感覚ニューロンの単離とナチュラルキラー細胞との共培養

神経節または感覚ニューロンのクラスターであるDRGを、その後の処理中にニューロンを保護するために、冷たい血清含有培地に取ります。

心分離し、上清を除去します。

消化酵素を含むリン酸緩衝液を加え、穏やかな攪拌でインキュベートします。

酵素は細胞外マトリックス(ECM)とDRG組織を解離し、細胞を緩めます。

酵素を不活性化するために血清含有培地を加えます。

遠心分離し、上清を廃棄します。

DRGを再懸濁し、徐々に小さいサイズのピペットを使用して組織を機械的に解離し、細胞懸濁液を取得します。

ウシ血清アルブミンの密度勾配に細胞を層状に重ねます。

遠心機。ニューロンは底に落ち着き、ペレットを形成します。

組織の破片を含む層を廃棄します。

ニューロンを培地に再懸濁します。

ニューロンをECMでコーティングされた培養皿に加え、インキュベートします。

培地を取り除き、ナチュラルキラー細胞またはNK細胞を加えます。

共培養に培地を加え、これらの細胞間の相互作用を研究します。

DRGを、10ミリリットルの氷冷で補充されたDMEMで満たされた15ミリリットルの円錐形チューブに収穫します。次に、製剤を室温で200 gで5分間遠心分離し、上清を除去します。コラゲナーゼIVミリリットルあたり1ミリグラム、およびミリリットルあたり2.4単位の分散物を含む250マイクロリットルのPBSも追加します。このDRGをコラゲナーゼ分散酵素溶液とともに、穏やかに攪拌しながら80分間インキュベートします。

酵素を不活性化するには、5ミリリットルの添加されたDMEM培地を加え、溶液を200gで遠心分離します。5分後、ピペットを使用して上清をそっと除去し、不要な細胞損失を避けるために約100マイクロリットルの上清を残します。次に、1ミリリットルのDMEMを添加したDMEMを細胞に加え、ピペットガンとサイズを小さくする3つのガラスパスツールピペットを使用して、DRGを穏やかに粉砕して単一細胞調製物にします。

P200ピペットを使用して、ニューロンを含む粉砕された神経節懸濁液をチューブの側面にBSA勾配に加えます。次に、加速と減速を最小に設定して、BSA勾配を含むニューロンを200gで12分間遠心分離します。遠心分離後、ピペットを使用してすべての上清を除去し、細胞を500マイクロリットルの神経基底に再懸濁します。

ラミニンでコーティングされた平底96ウェルプレートにウェルあたり10,000個のニューロンをプレートします。ニューロンの付着を可能にするには、96ウェルプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。共培養を開始するには、ニューロン培養物から神経基底をゆっくりと除去し、ウェルあたり10⁵個のNK細胞をニューロン培養物に加えます。