無血清胚様体の開発と維持

分

化培地-1またはDM-1中の神経前駆細胞またはNPC凝集体を含むウェルから始めます。

これらのNPCは、制御された条件下でDM-1を使用してヒト人工多能性幹細胞またはhiPS細胞から生成された神経系統の前駆体です。

NPC凝集体をDM-1を含むウェル内に配置されたメンブレンインサートに移し、余分な培地を除去します。

培地をDM-2に変更し、インキュベートします。

DM-2 は、NPC のさまざまな神経細胞型への成熟を促進する栄養素と分化因子を提供します。

未分化NPCは、培地に血清がないため、無血清胚様体またはSFEBとして知られる胚様体に変化します。これらのEBは、発達中の脳の形態に似ています。

インサートをDM-3を含むウェルに移します。

DM-3には、SFEBの維持と成長に不可欠な成長因子が含まれています。

SFEBが目的のサイズに達するまでインキュベートします。

細胞を培養して2週間後、40ミクロンの細胞培養インサートと1ミリリットルのDM1培地を含む6ウェルプレートを調製します。培養細胞を加える前に、これらのプレートを少なくとも4時間インキュベートします。

次に、200マイクロリットルの広口ピペットチップを使用して、約20マイクロリットルの培地で2週間前の細胞凝集体を収集します。最小限の溶液で4〜6個の骨材を各インサートに移します。余分なものを取り除きます。

このステップでは、迅速かつ安定した手で作業することが重要です。SFEBの周囲から媒体を除去すると、表面張力によりSFEBが溶液中を移動することがあります。媒体を取り除いた後、位置を変更しても問題ありません。

すべての凝集体がインサートにロードされたら、培地を1ミリリットルのDM2に変更し、細胞の培養を続けます。一日おきに培地の3/4を新鮮な培地と交換します。培養14日後、培養物へのDM3培地の添加を開始します。SFEBを成長させるために、さらに16日間培養を続けます。