人工ヒト人工多能性幹細胞の機能的運動ニューロンへの分化

細胞外マトリックスコーティングプレート上で培養したヒト人工多能性幹細胞(iPSC)コロニーを取ります。

iPS細胞は、運動ニューロンの分化を誘導する転写因子を発現するように遺伝子組み換えされています。

培地を取り除き、酵素を加えてコロニーを分離します。

細胞を機械的に解離して単一細胞懸濁液にし、それらを収集します。

遠

心分離して上清を除去します。

細胞のアポトーシスを阻止する阻害剤を含む培地に細胞を再懸濁します。

マトリックスコーティングされた皿に細胞をプレーティングします。

抗生物質ドキシサイクリンと低分子阻害剤を含む新鮮な分化培地を追加します。

ドキシサイクリンは転写因子の発現を誘導し、阻害剤は特定のシグナル伝達経路を遮断し、運動ニューロン前駆細胞へのiPS細胞の分化を促進します。

酵素を加えて細胞を剥離します。

細胞を集め、機械的に解離します。

遠心分離して上清を廃棄します。細胞をニューロン培地に再懸濁します。

接

着タンパク質でコーティングされたマイクロスライドに細胞をプレートして、細胞の接着を促進します。

培地中の成長因子は、運動ニューロンへの前駆細胞の成熟を誘導します。

運動ニューロンの分化のために、5容量のDMEM / F12培地を含む15ミリリットルのチューブに細胞を収集できるように実証されているように、安定してトランスフェクトされた細胞培養物を解離試薬で解離します。遠心分離後、カウントのためにマイクロモルROCK阻害剤を添加したヒトiPS細胞培地に細胞を再懸濁します。

マトリックスコーティングされた皿に細胞を6.25 x 10⁴細胞/センチメートル平方メートルの密度で播種します。次の2日間、上清をドキシサイクリンを添加した新鮮な分化培地に置き換えます。

2日目に、培地をガンマセクレターゼ阻害剤、血管内皮増殖因子受容体阻害剤、およびドキシサイクリンを添加したNeurobasal B27培地に変更します。5日目に、実証されているように細胞を解離し、分離した細胞を4ミリリットルのDMEM / F12培地に再懸濁して計数します。

ピペッティングは、細胞を完全に解離するために重要です。

製造元の指示に従って、運動ニューロン前駆細胞のアリコートを細胞凍結培地で凍結し、残りの細胞を遠心分離によって収集します。ペレットを10マイクロモルのROCK阻害剤を添加したニューロン培地に再懸濁します。

ポリオルニチンラミニンでコーティングされたマイクロスライド支持体に、ポリマーカバーガラスで1 x 10⁵細胞/センチメートル平方メートルの密度で細胞を播種します。6日目に、支持面から細胞を剥離せずに、下流の分析まで、培養用の阻害剤を含まない新鮮なニューロン培地に培地を慎重に交換します。