JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:33 分 • July 8th, 2025
ヒト角膜線維芽細胞を取り上げます。
それらを培地を含むマルチウェルプレート内のメンブレンインサートに移します。
メンブレンインサートに培地を追加します。インサートへの線維芽細胞の付着のためにインキュベートします。
次に、膜インサートとリザーバーにビタミンCを含む培地と交換します。
インキュベート。ビタミンCは線維芽細胞を刺激して3D細胞外マトリックスを分泌して組み立てます。
線維芽細胞上にヒト神経芽細胞腫細胞懸濁液を追加します。
インキュベートし、神経芽細胞腫細胞の接着を可能にします。
次に、レチノイン酸を含む培地を細胞上に加え、リザーバーに新鮮な培地を補充します。
インキュベート。レチノイン酸は神経芽細胞腫細胞から神経前駆細胞への分化を引き起こす
次に、メディアを取り出します。リザーバーに新鮮な培地を導入します。神経栄養因子を含む培地をメンブレンインサートに加え、インキュベートします。
神経栄養因子は、前駆細胞のニューロンへの分化を引き起こし、ヒト角膜線維芽細胞とニューロンの3D共培養モデルを生成します。
3Dコンストラクトを組み立てるには、まず、ヒト角膜線維芽細胞を継代してカウントします。次に、0.4ミクロンの細孔を持つポリカーボネート膜インサートに、約10倍10を6個のHCFに播種します。コンストラクトの上部に1.5ミリリットルの新鮮な培地を加えます。次に、同じ培地をさらに1.5ミリリットルを各コンストラクトの底にピペットで入れます。
24時間後、0.5ミリモルのビタミンCを添加した1.5ミリリットルの培地を各コンストラクトの上部と下部に加えます。摂氏37度で5%二酸化炭素で3週間インキュベートし、ビタミンCを含む新鮮な培地を1日おきに加えます。これにより、細胞が独自の細胞外マトリックスを分泌して組み立てるように刺激されます。3週間後、以前に組み立てた3Dコンストラクトの上に、3つのSH-SY5Yヒト神経芽細胞腫細胞に8×10
を加えます。このステップでは正確な細胞数を計算し、細胞分化を開始する前に24時間余裕があることが重要です。
24時間のインキュベーション後、10%FBSと10マイクロモルのレチノイン酸を含む1.5ミリリットルのEMEMで細胞を刺激することにより、SH-SY5Y細胞の分化を開始します。次に、ビタミンCを含む培地1.5ミリリットルをコンストラクトの底に加えます。レチノイン酸は光に敏感であるため、このステップは暗闇の中で実行する必要があります。
5日後、細胞が分化期に達したら、2ナノモルBDNFと1%抗生物質 - 抗真菌剤を含む1.5ミリリットルの無血清培地をコンストラクトの上部に加えます。新しいビタミンCを補給した培地をコンストラクトの底に加えます。さらに分析のために処理する前に、細胞をさらに2日間培養します。