パッチクランプ法による全細胞構成の確立

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ニューロンの生存率を維持するために人工脳脊髄液で満たされた電気生理学セットアップの記録チャンバーに配置された固定化されたマウスの脳スライスから始めます。

セットアップ

には、アンプと圧力制御ユニットに接続された、事前に組み立てられたカチオン溶液充填記録マイクロピペットが含まれています。

顕微鏡下でニューロンの位置を特定し、マイクロピペットをその近くに配置します。

正圧を加えて破片を取り除きます。

ニューロンの

近接を示すくぼみが膜に形成されるまで、マイクロピペットをニューロンに向かって動かします。

弱い吸引力を加えて、マイクロピペット内の小さなメンブレンパッチを引っ張ります。

これにより、マイクロピペットの抵抗を高める密閉性が形成され、安定した密閉性が確認されます。

細胞の安定性のために、細胞の電位を生理学的休止電位に維持します。

次に、短時間強い吸引を加えてパッチ膜を破壊し、細胞の内部との直接接続を確立します。

この全細胞構成は、ニューロンの電気的活動を記録する準備ができています。

顕微鏡のファインフォーカスホイールを使用して、マイクロピペットを徐々に下げながら焦点を合わせ始めます。常に最初に焦点を合わせてから、マイクロピペットを焦点面まで下げて、マイクロピペットの先端がスライスに突然浸透しないようにします。マイクロピペットがスライスの表面に接触したら、マイクロマニピュレーターの速度を中低モードに遅くします。軽い陽圧をそっと加えて、経路上の破片を取り除きます。

次に、X、Y、Zコントロールノブを交互に使用するか、Z軸のノブの回転に合わせて両方のXZ軸が変化する斜めに近づいて、セルに近づきます。マイクロピペットが細胞に十分近づくと、細胞表面にくぼみが現れます。

次に、ピペットホルダー吸引チューブに接続されているチューブを通して弱く短時間吸引を加え、シールを作成します。ギガシールが形成されている間、コンピューター制御のアンプコマンダーを使用して、細胞の保持電位を生理学的静止電位に引き上げ、膜が破裂した後の突然の変化を防ぎます。ギガシールが形成されたら、高速または低速の静電容量を補償します。

ここで、適用される吸引力が強すぎないことが非常に重要です、さもなければシールを確立する前に膜が破裂する可能性があります。

シールが安定しており、1ギガオームを超える場合は、短時間で強い吸引を加えて原形質膜を破裂させます。

膜を適切に破断し、安定した全セル構成を達成するために、吸引は短く、シールを確立するときに加えられる圧力よりも強くなければなりません。

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最終更新:1 8月 2026