0 閲覧数 • 3:45 分 • July 8th, 2025
内側前庭核(MVN)を含むマウス脳幹スライスを取ります。
ニューロンの生存率を維持するために、人工脳脊髄液で満たされた記録チャンバーにスライスを固定します。
顕微鏡でスライスを視覚化して、MVNニューロンを見つけます。
陽圧を加えて、細胞内環境を模倣する溶液で満たされたマイクロピペットを組織を通して前進させます。
ピペットがニューロンに接触すると、ニューロン膜がくぼみます。
負圧を加えて小さな膜部分を吸引し、しっかりと密閉します。
次に、負圧パルスを印加して膜を破裂させ、ニューロンとピペットの間に連続的な接続を作成します。
ニューロンにランダムなノイズ振幅を適用し、ノイズがニューロンの発火を誘発する閾値以下の振幅を特定します。
最後に、サブスレッショルドランダムノイズ振幅と組み合わせて、ニューロンにさまざまな電気刺激を加えます。
ニューロンゲインを測定します — ノイズの存在下で刺激に対する発火反応を調節するニューロンの能力。
全細胞パッチクランプ電気生理学の場合、まず、カリウムベースの内部溶液で満たされたときに3〜5メガオームの範囲の最終抵抗を持つマイクロピペットを引っ張り、浴に入れます。MVN内の個々のニューロンから全細胞パッチクランプ記録を取得するには、単一の組織スライスをインキュベーションチャンバーから標準的な電気生理学的セットアップの記録チャンバーに移し、U字型の重りにナイロン糸を使用してスライスを固定します。
記録チャンバーに、毎分3ミリリットルの流量で摂氏25度の炭素化aCSFを連続的に灌流し、マイクロピペットに内部溶液を充填します。ピペットを使用して少量の陽圧を加え、ピペットチップから破片を押しのけます。低出力の目標を使用して、MVN 内の個々のニューロンを見つけるために高出力に切り替える前に MVN を特定します。
ピペットで組織を破る前に、少量の陽圧を加えて破片をピペットの先端から押しのけ、マイクロマニピュレーターを使用してピペットを選択したニューロンに向かって動かします。神経膜に小さなくぼみが形成されるはずです。陽圧を解放し、少量の負圧を加えます。
1ギガオームのシールが達成されたら、吸引ポートを通してピペットホルダーに穏やかで短く鋭い負圧を加えてメンブレンを破裂させ、全セル構成を作成します。次に、標準プロトコルに従って全セル電流クランプ記録を取得します。
個々の内側前庭核ニューロンに確率的ノイズと正弦波ノイズを適用するには、振幅の範囲を3〜24ピコアンペアに設定してニューロンの閾値と発火速度を決定し、より低い刺激強度とより高い刺激強度をグループ化して感覚閾値を決定します。
次に、個々の電流レベルごとに脱分極電流ステップが注入される10秒間の平均発火速度を計算します。平均発火速度の値を使用して、発火速度と現在のプロットを生成します。次に、線形回帰分析を実行して、ニューロンのゲインを決定するために最適な適合線の勾配を決定します。