生細胞蛍光イメージングによる培養ニューロンの過酸化水素濃度の検出

コーティングされたカバーガラスで培養したゼブラフィッシュ網膜神経節細胞を取ります。

これらの細胞は、過酸化水素感受性酵素Orp1に融合した酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質roGFP2を産生する遺伝的にコードされたバイオセンサーを発現します。

培地の入ったカバーガラスを生細胞イメージングチャンバーに移し、チャンバーを倒立顕微鏡に置きます。

バックグラウンド蛍光を低減するために、培地を無血清培地に交換します。

過酸化水素レベルが低いため、roGFP2は還元されたコンフォメーションのままです。

バイオセンサーを405nmと480nmの波長で順次励起します。

還元されたroGFP2は、480 nmで励起ピークを示します。

過酸化水素含有媒体に切り替えます。

過酸化水素は細胞内に入り、Orp1と反応し、roGFP2を酸化します。

バイオセンサーを再度励起します。

酸化されたroGFP2は、405 nmで蛍光の増加を示し、480 nmで減少を示します。

蛍光強度比を計算します。

比率の増加は、細胞の過酸化水素レベルの増加を示します。

イメージング当日、顕微鏡で細胞をチェックし、RGC軸索の成長を検証します。生細胞イメージングの場合は、カバーガラスを培養皿から生細胞イメージングチャンバーに移します。DIC対物レンズ、OG590ロングパスレッドフィルター、EM-CCDカメラを搭載した倒立顕微鏡を使用してください。

イメージングする前に、ZFCM+培地をZFCM-に交換してください。10倍の対物レンズでセルを配置した後、油浸対物レンズを使用して60倍の倍率で画像を取得します。さらに1.5倍の倍率を使用します。

まず、DIC画像を取得し、次に適切なフィルターセットを使用してroGFP2-Orp1を画像化します。最初の画像セットを撮影した後、異なる処理溶液を含むメディアとメディアを交換します。pHと浸透圧の変化を避けるために、イメージングの30分ごとに培地を交換する必要があります。