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電気生理学セットアップの記録チャンバーで、人工脳脊髄液 (aCSF) に前頭前野皮質脳スライスを固定することから始めます。
このaCSFには、ニューロンのナトリウムチャネルを阻害するナトリウムイオンチャネル遮断薬が含まれています。
ガンマアミノ酪酸(GABA)を充填したパフマイクロピペットをシナプス後ニューロンの上に配置します。
イオン溶液で満たされた記録マイクロピペットを、同じニューロンの近くに電極を置きます。
弱い吸引を加えて、神経膜の小さなパッチでしっかりと密閉します。
次に、強力な吸引を加えてパッチされた膜を破壊し、ニューロンの内部へのアクセスを可能にします。
シナプス後ニューロンのリガンド依存性塩化物チャネルに結合する抑制性神経伝達物質であるGABAを送達します。
これによりチャネルが開き、塩化物イオンがニューロンに入り、抑制性シナプス後電流が生成されます。
一定の電圧で、シナプス後電流を記録します。抑制性シナプス後電流の増加は、ニューロン活動阻害におけるGABAの役割を反映しています。
スライスのサイズに合わせて先端を細くカットしたパスツールピペットを使用して、脳スライスを記録チャンバーに移します。次に、プラチナ スライス アンカーをスライスの上に置き、プラットフォームに保持します。その後、記録マイクロピペットに内部溶液を充填し、ビヒクルコントロールとしてパフマイクロピペットに10マイクロモル、50マイクロモル、および100マイクロモルまたはaCSFのGABAを充填します。
破片による詰まりを防ぐために、記録電極を aCSF に浸す前に、1 ミリリットルの注射器を使用してわずかな陽圧を加えてください。顕微鏡下で、先端がモニターの中央に現れるように記録電極とパフマイクロピペットを配置します。次に、ターゲットニューロンを特定します。パフマイクロピペットを徐々に下げながら顕微鏡の焦点を調整し、記録ニューロンの上に45度の角度で置きます。
パフマイクロピペットの先端と標的ニューロンの間の距離を20〜40マイクロメートルの範囲に保ちます。ゆっくりと慎重に、記録電極でニューロンに近づき、陽圧を解放します。電極ホルダーに接続されたチューブに弱く短時間の吸引を加えて、ギガオームのシールを作成します。電圧をゼロミリボルトに維持します。
ギガオームシールの形成後、高速および低速の静電容量を手動または自動で補償します。次に、チューブに短時間強く吸引を加えて、全セルモードに侵入します。続いて、電圧クランプモードで誘発されたIPSC電流を記録します。
マスター8電圧ステップジェネレーターによって制御されるパフマイクロピペットを介して、1つまたはペアのGABAパフを供給します。パフ時間を変更して、最良の誘発 IPSC 電流の結果を取得し、誘発 IPSC 電流を測定します。