共培養脊髄切片におけるニューロン再生を評価するための電気生理学的記録

ポリマーでコーティングされた多電極アレイまたはMEAを取り、共培養胚脊髄スライスを2つの別々のゾーンに配置し、両方のスライスから同時に記録できるようにします。

ライスは、以前に病変した領域で再生された神経接続を示しています。

ニューロンの生存を維持するために、イオンと栄養素が豊富な細胞外溶液を含む記録チャンバーにMEAを配置します。

システムを安定させ、ニューロンの適応とコミュニケーションを促進します。

ニューロンは、MEAの近くの電極によって記録される活動電位と呼ばれる電気信号を介して通信します。

各電極からの個々の信号が結合され、各スライスから電気信号が生成されます。

ニューロンの安定性を維持するために、細胞外溶液を定期的に交換します。

ニューロン膜上の抑制性神経伝達物質受容体を遮断する阻害剤を含む細胞外溶液を追加し、ニューロンを長期間活性に保ちます。

両方のスライスの電気的活動を比較します。2つのスライス間の同期された電気信号は、シナプス接続と神経再生の成功を確認します。

コーティングされた微小電極アレイを備えたペトリ皿を実体顕微鏡下に置きます。アレイに焦点を合わせ、6マイクロリットルのチキンプラズマ液滴を電極アレイの中央に配置します。小さなへらを使用して、腹側を向かい合わせにして 2 つの脊髄切片を血漿液滴に慎重にスライドさせます。

次に、鶏の血漿液滴の周りに8マイクロリットルのトロンビンを追加します。次に、ピペットチップを使用して、鶏の血漿とトロンビンの混合物を注意深く混合し、広げます。鶏の血漿とトロンビンの混合物が粘りすぎて凝固し始める直前に、余分な液体を吸引します。次に、シャーレに蓋をし、加湿チャンバーに入れます。

チャンバーを摂氏37度のインキュベーター内に約1時間置きます。インキュベーション後、10マイクロリットルの栄養培地をサンプルに慎重に加えます。ペトリ皿に蓋をし、さらに45分間インキュベーターに戻します。次に、多電極アレイ培養アセンブリのそれぞれをローラーチューブに入れ、3ミリリットルの栄養培地を加えます。ふたをしっかりと閉め、ローラーチューブをローラードラムに入れます。ドラムを摂氏37度のインキュベーター内で1〜2 RPMで回転させます。

菌ゴム先端鉗子を使用して、多電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブから取り外し、実体顕微鏡下でペトリ皿に入れます。組織に焦点を合わせ、2つのスライスが融合していることを確認します。次に、アセンブリを安定させ、組織スライスに近い多電極アレイの溝にメスの刃を置きます。メスをかなり水平に持ち、メスのハンドルを持ち上げますが、メスの刃が根元から先端に転がり、組織を切断し、溝を覆うようにメスの刃をアレイの溝に留めます。

必要に応じて、25ゲージの針先で残存組織の接続を切断します。溝内の領域でのみ作業し、柔らかいエッジには触れないでください。多電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブに戻し、3ミリリットルの新鮮な栄養培地を培養物に加えます。次に、ローラーチューブを摂氏37度のインキュベーター内のローラードラムに戻します。

多電極アレイ培養アセンブリを記録チャンバーに取り付け、約500マイクロリットルの細胞外溶液をアレイに適用します。次に、アセンブリを顕微鏡に取り付けます。システムが安定するまで10分間待ってから、各活動検出電極からの基本的な自発活動を10分間記録します。録音を合計2回繰り返します。

安定した細胞外状態を確保するには、記録セッションごとに細胞外溶液を交換してください。必要に応じて、1マイクロモルのストリキニーネと10マイクロモルのガバジンを含む細胞外溶液を適用することにより、ネットワークを脱阻害し、電気的活性を記録する前に少なくとも2分間待ちます。