トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生における獲物誘発神経活動の解析

低融点アガロースに固定化された麻酔をかけたトランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫を含む行動記録チャンバーから始めます。

幼虫の中脳前蓋壁領域と視床下部の下葉には、蛍光カルシウム指標を発現する修飾ニューロンが含まれています。

幼虫の頭の周りのアガロースを取り除き、水で洗って残留アガロースを取り除きます。

ゾウリムシを獲物として幼虫の近くに置きます。

記録チャンバーを蛍光顕微鏡下に移します。

獲物が泳ぐと、幼虫の目がそれを検出し、獲物の検出に関与する蓋前領域と視床下部領域に信号を送信します。

これにより、これらのニューロンのカルシウムチャネルが開き、カルシウムイオンがカルシウム指示薬に入って結合し、蛍光発光につながります。

タイムラプスイメージングを記録して、獲物の遊泳経路に沿ったニューロンからの蛍光強度を検出し、カラーマップを生成します。

この地図では、矢じりは獲物の軌跡を表しており、黒い矢印はニューロンの興奮を示し、色付きの矢印は獲物の動きによって引き起こされるニューロンの興奮の増加を示しています。

テキストプロトコルに従ってゾウリムシを培養し、ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔した後、幼虫を2%の低融点アガロースに入れ、アガロースの表面がわずかに凸状に見えるように余分なアガロースをすぐに取り除きます。解剖針を使用して、幼虫を直立位置にすばやく向けます。

次に、外科用ナイフを使用して、アガロースにいくつかの小さな切り込みを入れて、ゾウリムシが泳ぐスペースを作るゼブラフィッシュの頭の周りのアガロースを取り除きます。チャンバーにシステム水をそっと注ぎ、残留アガロースを慎重に取り除きます。次に、ゾウリムシを1匹記録室に入れ、視覚刺激として機能します。

次に、記録チャンバーを科学用CMOSカメラを備えた落射蛍光顕微鏡の下に置き、2.5倍の対物レンズを選択します。搭載カメラの画像取得アプリケーションを起動します。[シーケンスペイン] をクリックし、ペインで [ハードディスクレコード] を選択します。[スキャン設定]セクションで、フレーム数を900またはその他の必要な合計フレーム数に設定します。

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キャプチャ] ウィンドウで、[露光時間] を 30 ミリ秒に設定し、[ビニング] を 2 x 2 に設定します。キャプチャ ペインの [ライブ] をクリックして、カメラ ビューで幼虫を見つけてフォーカスし、[ライブの停止] をクリックして [開始] ボタンをクリックします。ムービーを.cxd形式で保存し、テキストプロトコルに従ってデータを分析します。