ニューロンに対する微小機械的刺激による軸索静脈瘤の誘導

まず

、チューブが取り付けられたマイクロピペットをマイクロマニピュレーターに固定します。

チューブのもう一方の端を、回転可能なバルブ付きのコネクタを介して、塩緩衝液で満たされたシリンジに取り付けます。

軸

索に静脈瘤を誘発するのに十分な圧力を提供する高さにシリンジを設定します。

軸索静脈瘤は、軸索の長さに沿って発生するビーズ状の腫れです。

マイクロピペットを培養皿に対して希望の角度に配置します。

顕微鏡からの蛍光を使用してマイクロピペットの先端を位置合わせし、塩緩衝液を含む細胞培養皿の表面近くに下げます。

次に、透過光をオンにし、蛍光フィルターをオフにします。

ニューロンの入ったカバーガラスを皿の上に置きます。

まず、マイクロピペットに焦点を合わせ、その位置を調整します。

次に、標的ニューロンを含む領域に焦点を当てます。

バルブを開いて流体圧力を加えます。この微小機械的刺激は、これらのニューロンに静脈瘤を誘発します。

この手順では、ピペットをマイクロマニピュレーターのネジ上部に挿入して所定の位置に保持します。ピペットを細胞培養皿の表面に対して45度の角度で傾けます。蛍光フィルターをオンにします。絞りを開き、対物レンズを通して蛍光スポットが見えることを確認します。

マイクロマニピュレーターを使用して、先端が蛍光スポットと一直線に並ぶ位置にピペットを動かし、細胞培養皿の高さのすぐ上の位置にピペットを下げます。所定の位置に収まったら、透過光をオンにし、蛍光をオフにします。ピンセットを使用して、細胞がピペットを向くカバーガラス1枚を細胞培養プレートから室温で2ミリリットルのハンクバッファーを含む細胞培養皿に移します。

ファインフォーカスノブと20倍の対物レンズを使用して、セルの約4回転上の平面に焦点を合わせます。続いて、マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットチップが接眼レンズを通して見えるように、焦点が合って平面の中央左側に位置するように配置します。ピペットを所定の位置に配置したら、顕微鏡を関心領域を含む平面に焦点を合わせます。

7DIVのイメージングでは、GFPトランスフェクトされたマウス海馬ニューロンは、パフの前後に軸索を示しました。