ゼブラフィッシュ胚における運動ニューロンの電気生理学を研究するための非侵襲的アプローチ

遺伝子操作されたゼブラフィッシュの胚を実体顕微鏡下に置き、脊髄運動ニューロンによって引き起こされる自発的な尾のコイリングを観察します。

これらのニューロンの固有の特性により、ナトリウムチャネルを介したイオン流入が引き起こされ、自発的な膜の脱分極と筋肉に伝播する活動電位の生成が引き起こされ、テールコイリングが引き起こされます。コイリング周波数を測定します。

いくつかの胚をナトリウムチャネル遮断薬に移して、ナトリウムの流入を抑制し、コイリング頻度の低下を評価します。

未処理の胚を溶融アガロースにマウントします。アガロースを固化させて動きを制限し、蛍光顕微鏡で観察します。

運動ニューロンは、ドナーとアクセプターの蛍光色素に融合した膜結合電位感知ドメイン(VSD)を持つバイオセンサーを発現します。

脱分極はVSDのコンフォメーションを変化させ、蛍光色素を近づけます。

励起されると、ドナーはエネルギーをアクセプターに伝達し、アクセプター蛍光放出を引き起こします。

ブロッカーを添加して脱分極を阻害し、アクセプター放出を減少させ、ニューロンの自発的脱分極のブロッカー媒介阻害を確認します。

自発的なテールコイリング分析のために、胚を0.2%DMSOを含む魚の水で満たされた90ミリメートルの丸いペトリ皿に移し、鋭い先端または針を備えた2つの宝石商の鉗子を使用して手動でそれらを除去します。その後、胚を摂氏28度で5分間インキュベートします。実体顕微鏡に搭載されたデジタルカメラを使用して、1分間のビデオ録画中に室温でテールコイリングを検出します。

次に、30フレーム/秒の時間分解能で時系列を取得します。次に、単位時間あたりの曲げ回数を数えて、自発的なテールコイリングの頻度を計算します。薬リルゾールの効果を評価するには、胚を5マイクロモルのリルゾールを含む魚の水で満たされた新しい90ミリメートルのペトリ皿に移します。次に、胚を摂氏28度で5分間インキュベートしてから、1分間のビデオを録画して行動分析を実行します。

次に、20〜24hpfの胚を、摂氏37度の35ミリメートルのガラス底イメージング皿内の魚水中の魚水中の1%低融点アガロースにマウントします。胚を横向きにし、アガロースが室温で固まるまで待ちます。

次に、イメージング皿を共焦点顕微鏡のステージに移します。488ナノメートルのアルゴンレーザーで単量体Umikinoko-Greenを励起することにより、バイオセンサーを発現する運動ニューロンを同定します。次に、その発光を495〜525ナノメートルに設定し、[記録]を押します。

FRET測定の場合は、FRETのドナーであるmUKGを励起し、488ナノメートルのレーザーとペアを組みます。同時に、2つの光電子増倍管を使用して、ドナーから発せられる蛍光と単量体Kusabira-Orangeアクセプターから発せられる蛍光を検出します。実験の開始時に、mUKG蛍光が記録される光電子増倍管1のゲインとオフセットを最適化し、セッション全体を通してそれらを一定に保ちます。

オフセットを設定するには、Q ルックアップ テーブルを使用して、画像の色を強度値に変更します。レーザーをオフにしてスキャンしている間は、オフセットスライダーを使用して、背景ピクセルの強度がゼロよりわずかに高くなるようにします。同じルックアップテーブルを使用して、レーザーのスイッチを入れます。スキャン中は、ゲインスライダーを使用して、飽和ピクセルを避けるように注意しながら、信号対雑音比を最大化します。

ソフトウェア取得ウィンドウで、ドロップダウンメニューからxyt取得モードと512 x 64ピクセルの画像フィールドサイズを選択します。次に、胚の脊髄ニューロン電圧の変化の記録を設定して、1分間30ミリ秒ごとに1つのxy面を取得します。同じニューロンの膜脱分極に対するリルゾール投与の効果を評価し、5 マイクロモルのリルゾールを含む魚水を添加してから 5 分後に新しいデータセットを取得します。