動けなくなったゼブラフィッシュ幼生における求心性ニューロンからの電気信号のモニタリング

電気生理学的セットアップで細胞外溶液で満たされた記録チャンバーで固定され、麻痺したゼブラフィッシュの幼虫から始めます。

求心性マイクロピペットに、ニューロン活動を記録するための導電性を提供するイオンを含む細胞外溶液を満たします。

信号記録用のアンプに接続された記録電極を含むマイクロマニピュレーターに組み立てます。

ピペットの目詰まりを防ぐために、陽圧を加えます。

ピペットチップを側線神経に沿って動かし、求心性神経細胞体のクラスターを含む求心性神経節に隣接して配置します。

これらのニューロンの細胞突起は、水の動きを感知する側線に沿って位置する有毛細胞に接続されています。

次に、穏やかな負圧を加えて、マイクロピペットと求心性神経節の間に緩いシールを形成します。

固定化された幼虫の有毛細胞から感覚入力を受け取る求心性ニューロンからの電気信号を記録します。

ゼブラフィッシュの幼虫を固定化し、先端の大きいトランスファーピペットを使用して35ミリメートルのシャーレに移します。周囲の溶液をできるだけ取り除きます。幼虫を10マイクロリットルの0.1%アルファブンガロトキシンに約5分間浸します。麻痺した幼虫を細胞外溶液で10分間洗浄します。次に、トランスファーピペットを使用して、幼虫を細胞外溶液浴からシリコン底の記録皿に移動します。

実体顕微鏡下で、先端の細い鉗子で幼虫をシリコンマットの中心の上にそっと置き、体の前端と後端を左から右に伸ばします。先端の細い鉗子を使用して、エッチングされたピンを幼虫の背側脊索を通してシリコンに直交し、肛門の背側に直接挿入します。尾の端近くの脊索に2番目のピンを挿入し、ガスブラダーの脊索背側に3番目のピンを挿入します。4番目のピンを耳小胞に挿入し、ピンが封止材に挿入されるときにわずかに回転させます。

わずかな回転が適用されるように、cleithrumと耳小胞の間の組織を見て、求心性体腫のクラスターを明らかにします。固定された溶岩をDIC顕微鏡の固定ステージ上の10倍対物レンズの下に置き、筋肉ブロックの筋中隔裂を左ヘッドステージベクトルに平行に向けます。

アース線を浴液に入れ、左ヘッドステージに接続されていることを確認します。求心性記録電極に30マイクロリットルの細胞外溶液を満たし、右側のヘッドステージピペットホルダーに挿入します。次に、空気圧トランスデューサーによって生成された正圧を加えながら、それを皿溶液に下げます。

電極の位置を確認し、電極の先端を試料の上に持っていきます。マイクロマニピュレーターを使用して、求心性電極の先端がクレスラムより上の位置を保持するまで下げます。倍率を浸漬の40倍に上げ、後外側線神経とcleithrumの交点を見つけます。電極の先端を求心性神経節の上に持ってきて、先端が上皮に接触するまでピペットを下げます。先端の周囲全体が求心性神経節に接触するように、電極をゆっくりと操作します。