冠状海馬切片における誘発カリウムイオン濃度ダイナミクスの測定

マウス冠状脳スライスを aCSF で満たされた記録チャンバーに固定します。

バイポーラ刺激電極を海馬のCA3領域の放射層に挿入します。CA3ニューロンは、シェーファー側副と呼ばれる軸索をCA1に投影します。

カリウムイオン選択電極をCA1放射層に配置します。

CA3ニューロンを電気的に刺激して、電位依存性ナトリウムチャネルを開きます。ナトリウムイオンの流入は、脱分極と呼ばれる膜電位を正に変え、活動電位を生成します。

脱分極のピークの後、ナトリウムチャネルは不活性化し、電位依存性カリウムチャネルはカリウムイオンの流出を可能にし、膜を再分極させます。その後、膜電位が回復し、活動電位がCA1に伝播します。

カリウムイオン選択電極は、応答曲線で示される流出を測定します。

電位依存性ナトリウムチャネル活性を阻害するブロッカーを追加します。電気刺激を受けると、カリウムイオン応答の欠如は、そのダイナミクスがシェーファー側副線路の活動電位によるものであることを確認します。

カリウムイオンのダイナミクスを測定するには、パスツールピペットを使用して脳スライスを浴槽にそっと置き、ナイロン弦付きのプラチナハープでそっと所定の位置に保持します。バイポーラ刺激電極の先端が互いにほぼ平行であり、スライスの平面と同じ高さであることを確認します。5〜7秒かけて、電極を深さ約40〜50マイクロメートルのCA3放射層にゆっくりと挿入し、シェーファー側副血行路を刺激します。

次に、カリウムイオン選択電極をCA1放射層に約3〜4秒かけてゆっくりと下げて、約50マイクロメートルの深さまで慎重に挿入します。スライスに刺激を加える前に、電極全体で電位が安定するまで待ちますが、これには通常5〜10分かかります。スライスが細胞外カリウムイオン濃度の過度の自発的な変化を示す場合は、破棄し、新しいスライスでプロセスを繰り返します。

誘発カリウムイオン放出を測定するには、応答をデジタルで記録しながら、刺激アイソレーターを介して一連の電気刺激を適用します。10マイクロアンペアの刺激振幅から始めて、10ヘルツと1ミリ秒/パルスで刺激を加えます。最大カリウム応答振幅が検出されるまで、刺激振幅を2倍に増加させます。応答が観察されない場合は、カリウムイオン選択電極の位置を100マイクロメートル刻みで刺激部位に近づけます。

カリウムイオン濃度の変化が、電気的に活性化されたシェーファー側副線路浴の活動電位発火によって媒介されることを確認するには、aCSF に 0.5 マイクロモルの TTX を 10 分間適用し、刺激プロトコルを繰り返します。誘発された反応は観察されるべきではありません。