マウス脳スライスにおける単一ニューロンシナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスの解析

酸素化されたaCSFに沈めたマウス前脳スライスを含む電気生理学的セットアップから始めます。

aCSF には、ナトリウムイオンチャネルを選択的に阻害し、ナトリウム誘発性ニューロンの興奮を防ぐイオンチャネル遮断薬が含まれています。

皮質ニューロンは、蛍光グルタミン酸検出センサータンパク質を発現します。

興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸を放出できる単一のシナプス前ニューロン軸索ブトンを、シナプス後ニューロンと接続する接合部で

見つけます。

このブートンの近くに刺激電極を配置し、脱分極電流を印加します。

これによりシナプス前ニューロンが興奮し、カルシウムイオンの流入が引き起こされ、グルタミン酸の放出が促進されます。

選択したブートンの周りの蛍光強度の記録を開始します。

放出されたグルタミン酸は、シナプス後ニューロンのセンサータンパク質および受容体と相互作用します。

一方

、選択した領域をレーザー光で照らし、グルタミン酸結合センサータンパク質に蛍光を発します。蛍光強度の増加は、グルタミン酸の放出を示します。

時間が経つにつれて、グルタミン酸はセンサータンパク質から解離して星状細胞に入り、蛍光強度の低下を引き起こし、グルタミン酸クリアランスを示します。

顕微鏡XYドライブを使用してグルタミン酸の放出とクリアランスを視覚化するには、テストされたグルタミン酸センサー陽性のブートンを視野中心の近くに置きます。取得を停止した後、マウスの左ボタンで画像をクリックして、静止したブートン中心のXY位置を決定します。設定したカーソルのXY座標が表示されます。

キャリブレーションデータを使用して、示されている式を使用して、グルタミン酸センサー蛍光の励起のためにレーザービームを送信するサイトの座標を計算します。レーザー制御ソフトウェアで1点シーケンスを作成するには、レーザー制御ソフトウェアのシーケンスページにあるシーケンスに追加ボックスでポイントを選択し、実行と実行遅延を0に設定し、シーケンスをTLLで実行するように設定します。次に、[シーケンスの開始] をクリックします。

カメラ制御ソフトウェアで、適切なイメージングパラメータを選択し、トリガーモードに外部スタートを選択します。カメラ制御ソフトウェアで[信号を取る]をクリックします。次に、トリガー デバイス用に定められた実験プロトコルを開始し、適切なタイムラインで実験プロトコルの試行を実施して、カメラが 0.1 ヘルツ以下の繰り返し周波数で 1 回の試行中に 2.48 キロヘルツの周波数で 400 フレームを取得するようにします。

病理学的シナプスを特定するには、標高ルーチンをオンにして、選択した静止時の関心領域の蛍光強度平均と標準偏差を計算します。静止時の蛍光強度が平均に3標準偏差を加えた値を超えるピクセルが占める領域を決定してボックス