マウス海馬切片におけるニューロンの光刺激および全細胞パッチクランプ記録

酸素化されたaCSFを灌流した電気生理学記録チャンバーで固定化されたトランスフェクトされたマウス脳スライスを取ります。

このスライスには、蛍光タンパク質に融合した感光性イオンチャネルを発現する視床ニューロンの軸索末端が含まれています。

蛍光視床ニューロン軸索を視覚化し、錐体ニューロンを選択します。

細胞内溶液中の電極を含む記録ピペットを、わずかな陽圧で選択したニューロンに向かって前進させます。

陽圧は、接触すると神経膜にくぼみを作ります。

圧力を解放して高抵抗シールを形成します。

膜電位を一定の負の値に設定します。

負圧パルスを印加して膜を破断し、全セル構成を実現します。

軸索終末を照らし、光に敏感なチャネルを活性化し、神経膜を脱分極させ、活動電位を誘発します。

興奮性神経伝達物質が放出され、記録されたニューロン上の受容体に結合し、陽イオンの流入を引き起こします。

結果として生じる興奮性シナプス後電流を記録し、ニューロン間の直接シナプス接続を示します。

全細胞パッチクランプ記録を実行するには、海馬複合体を含む脳スライスを記録チャンバーにそっと移します。毎分2〜3ミリリットルのカルボゲンで泡立った摂氏34度のACSFで記録チャンバーを連続的に灌流します。4倍倍の青色LED照明で、関心領域の軸索終末におけるクロノスGFP発現を簡単に調べます。

63倍の没入対物レンズに変更し、フォーカスを調整します。Chronos GFPを発現する軸索を確認し、パッチ記録用の錐体ニューロンを選択します。次に、ピペットにグルコン酸カリウムベースの内部溶液を入れます。ヘッドステージのピペットホルダーに取り付けます。電圧クランプ構成でセルにパッチを当てます。

同定されたニューロンに近づき、ピペットチップを体細胞にそっと押し付けます。陽圧は膜表面にくぼみを生成するはずです。次に、圧力を解放してギガオームシールを作成します。密閉したら、保持電圧をマイナス 65 ミリボルトに設定します。

負圧の鋭いパルスで膜を壊します。クロノスを発現する求心性線維の475ナノメートルLED全場刺激に対する電流または電圧クランプシナプス後応答を記録します。20ヘルツで2ミリ秒の持続時間の10回の刺激で刺激します。