脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

まず、

灌流室内のメッシュグリッド上で曝気された人工脳脊髄液またはaCSFを灌流します。

蛍光タンパク質発現ニューロンを含む脳スライスを移し、白金配線デバイスで固定します。

メッシュグリッドを回転させて位置合わせします。

マルチチャンネルプローブをスライスに向かって下げます。

蛍光タンパク質の可視化のためにフィルターキューブを調整します。

スライスを回転させてプローブを位置合わせします。

組織表面より下のプローブの高さを調整します。

次に、aCSFを灌流し、蛍光標識ニューロンに焦点を当てます。

高倍率の対物レンズを使用して、組織に焦点を合わせ、励起光を調整します。

適切な光フィルターを使用して、ニューロンの蛍光を観察します。

対物レンズを調整してパッチピペット用のスペースを作り、陽圧を加えます。

次に、ピペットをニューロンの近くに配置して、膜ディンプルを形成します。

最後に、弱い吸引を加えて膜シールを作成し、続いて強い吸引を加えて膜を破壊し、標的のニューロンから電気的記録を取得します。

マルチチャネルプローブをex vivo脳組織スライドに配置するには、毎分3〜6ミリリットルでバブルした実験用ACSFを灌流し、関心領域を含む脳スライスを顕微鏡灌流チャンバー内のメッシュグリッドに移します。脳のスライスをプラチナハープで固定します。マルチチャンネルプローブの遠位端にある電極接触の線がPL表面に対してほぼ垂直になるようにメッシュグリッドを回転させます。

広視野照明とマイクロマニピュレーターの微細な制御下で、マルチチャンネルプローブをスライスの表面に向かって下げます。皮質求心性神経の軸索末端で発現する蛍光レポータータンパク質の視覚化のために、適切なフィルターキューブを作動させます。

必要に応じて、スライスを回転させて、プローブをPLサーフェスに正確に位置合わせします。プローブをスライスの平面のすぐ上、x軸に沿って最終的なターゲット位置から200マイクロメートル短く配置し、記録される組織の領域の外側に少なくとも1つのチャネルを残します。ゆっくりと、プローブを縦軸に沿ってスライスに挿入します。

組織への損傷を最小限に抑えるために、鋭い先端が組織表面のすぐ下に見える程度にのみプローブを進めてください。実験用ACSFソースを袋入り対照溶液に切り替え、ターゲットパッチクランプ記録用の蛍光標識細胞を同定します。開口部を最小の直径に制限し、マルチチャンネルプローブと対物レンズが接触しないように注意しながら、高出力の水浸対物レンズをかみ合います。組織に焦点を合わせます。

マルチチャンネルプローブに隣接するが、重ならないように組織の領域に光を集中させます。適切なフィルターセットを使用して、Cre依存性蛍光マーカーを発現する細胞のイメージングを可能にします。対物レンズを上げて、パッチピペットを下げるための十分なスペースを作ります。

パッチピペットに内部溶液をロードし、電極ホルダーに取り付けます。1ミリリットルのシリンジを使用して、約0.1ミリリットルの空気に対応する正圧を加えます。パッチピペットを溶液に下げ、視覚的な誘導下でチップに焦点を合わせ、標的細胞から全細胞記録を取得します。