全細胞パッチクランプを用いたキスペプチンニューロンに対する成長ホルモンの試験効果の決定

トランスジェニックマウス視床下部スライスを、aCSFで灌流された記録チャンバーに固定します。

スライスには、生殖器系の調節に不可欠な蛍光融合タンパク質発現キスペプチンニューロンが含まれています。

記録電極を含むマイクロピペットを内部溶液に組み立てます。

蛍光キスペプチンニューロンを顕微鏡的に特定します。

ピペットに陽圧を加え、標的ニューロンに向かって進めます。接触すると、圧力が神経膜にくぼみを作ります。

短時間負圧を加え、マイクロピペットとメンブレンの間に高抵抗シールを形成します。

正確な測定のために、ニューロンの生理学的静止電位に保持電圧を設定します。

短い負圧パルスを印加して膜を破壊し、セル全体の構成を確立します。

パラメータを監視してニューロンの生存率を確認します。

テスト成長ホルモンを導入し、シグナル伝達経路をトリガーし、ニューロンの膜電位の変化を誘導します。

膜電位の変化を測定して、神経活動に対する成長ホルモンの阻害効果を決定します。

アクリルトランスファーピペットを使用して、目的の脳スライスを一度に1つずつ記録チャンバーに移します。スライスをスライスアンカーで保持して、aCSF灌流中にスライスが動かないようにします。浸漬顕微鏡の低倍率対物レンズ10倍または20倍を使用して、スライスを記録チャンバーの中央に配置します。

スライスの位置は、顕微鏡下で目的の領域をよく見ることができ、記録マイクロピペットが完璧に届くようにするために重要です。目的領域を特定した後、対物レンズを高倍率レンズ(63倍)に切り替え、組織レベルに焦点を合わせ、内因性蛍光タンパク質と標的領域の細胞の形状を観察して、脳スライスの表面にあるキスペプチン細胞を見つけます。

可能なターゲットセルが見つかったら、マウスカーソルで、または関心のある領域に正方形のような書式を描画して、コンピューター画面にマークを付けます。マークされたコンピューター画面は、記録マイクロピペットの位置をセルに誘導するのに役立ちます。ターゲットセルの正確な位置を特定した後、対物レンズを持ち上げ、内部溶液で満たされた記録マイクロピペットを電極ホルダーに導入し、内部溶液が銀電極と接触していることを確認します。

ピペットをaCSF溶液に浸す前に、ポリエチレンチューブを介してマイクロピペットホルダーに接続された1〜3ミリリットルの空気充填シリンジを使用して、マイクロピペットをaCSF溶液に浸す前に、破片がマイクロピペットに入るのを防ぎます。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを対物レンズの中心の下に導きます。マイクロマニピュレーターボタンを動かして、マイクロピペットのx、y、z軸を目的のセルに向かって誘導します。

マイクロピペットの先端が見えるように焦点を調整し、焦点を近づけますが、スライスに近づきすぎないようにします。マイクロマニピュレーターの速度を下げ、マイクロピペットを焦点面までゆっくりと下げ、マイクロピペットの先端がスライスに突然浸透せず、細胞の表面または標的領域に接触するまでゆっくりと下降するようにします。

1〜3ミリリットルの空気で満たされたシリンジで軽い陽圧を加えて、アプローチパスから破片を取り除き、x、y、z軸のマイクロマニピュレーターをゆっくりと動かしてマイクロピペットチップを近づけ、ターゲットセルに触れると、加えられた圧力によってディンプルが発生します。ディンプルを確立した後、ソフトウェアの電圧クランプモードを使用して、マイクロピペットホルダーに接続されたチューブを通して1〜2秒間、口から弱い短時間の吸引を加えて、マイクロピペットとセルの間にシールを生成します。

シールがノイズ干渉なしに機械的に安定しているのが約1分間であれば、保持電圧を目的のセルの最も近い生理学的静止電位に設定します。キスペプチン視床下部ニューロンには、マイナス50ミリボルトが推奨されます。次に、破裂した膜がマイクロピペットを詰まらせたり、かなりの膜部分または細胞を引き付けたりしないように、細胞に密閉されたマイクロピペット先端で原形質膜を口から短時間吸引して破壊します。

十分な力で吸引を行うことで、適切な全細胞構成を実現できます。使用したシステム設定マニュアルを確認してください。細胞膜を破壊した後、電圧クランプモードで[セル全体]オプションを有効にし、[セル全体]タブを参照する自動コマンドをクリックします。

次に、テキスト原稿に記載されているように、ソフトウェアで細胞生存率パラメータを確認します。実験中に直列の抵抗とセルの定常状態静電容量を監視します。全セル構成が適切に達成されたら、電圧クランプモードでシナプス電流を測定します。現在のクランプモードでの静止膜電位の変化と誘発された静止膜電位の変化を記録します。