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ラット脊髄スライスを記録チャンバーに入れ、組織アンカーで固定します。
スライスに人工脳脊髄液を灌流します。
顕微鏡下で、半透明のゼラチノーサまたはSG領域を特定し、健康なSGニューロンを選択します。
イオン溶液で満たされたパッチピペットをニューロンの近くに配置します。
穏やかな陽圧を加えて、ピペットチップから破片を取り除きます。
ピペットをニューロンに向かって動かします。
次に、陽圧を解放してニューロン膜にくぼみを形成し、シールを作成します。
保持電位を変更して、静止膜電位(RMP)に近づけます。
短時間の吸引を使用して膜を破裂させ、細胞全体の構成を確立します。
RMPでは、脱分極電気パルスを印加します。
これらのパルスは電圧依存性ナトリウムチャネルを開き、ナトリウムイオンの急速な流入を可能にします。
このイオンの流入は活動電位を引き起こし、ニューロンの発火をもたらします。
ニューロンの発火パターンを記録します。
ゼラチノーサまたはSGニューロンから全細胞パッチクランプ記録を行うには、カリウムイオンベースの細胞内溶液を使用して記録し、セシウムカチオンベースの溶液を抑制性シナプス後電流の記録にのみ適用します。
脊髄スライスを記録チャンバーにそっと移動させ、ナイロン糸付きのU字型のプラチナワイヤーでしっかりと安定させ、最適なスライスの安定性を実現します。室温でバブルしたACSFでスライスを着実に灌流し、十分な酸素化を達成するために灌流速度を毎分2〜4ミリリットルに設定します。
次に、低解像度の顕微鏡レンズを使用して、SGニューロンの領域を半透明のバンドとして識別します。高解像度の対物レンズを使用して、明るく滑らかな膜を持つ立体的な形状を特徴とする健康なニューロンをターゲット細胞として選択し、ビデオモニター画面の中央に調整します。
マイクロピペットに適切な量のカリウムイオンベースまたはセシウムイオンベースの細胞内溶液を満たします。次に、マイクロピペットを電極ホルダーに挿入し、細胞内溶液がホルダー内の銀線に接触していることを確認します。マイクロピペットに焦点を合わせ、マイクロマニピュレーターを使用してACSFに浸します。穏やかな陽圧を加えて、汚れや破片を押し除きます。
マイクロピペットを標的のニューロンに向かって徐々に動かします。ピペットがニューロンに近づき、ニューロン膜に非常に小さなくぼみが形成されたら、陽圧を解放してギガシールを形成します。保持電位を、細胞の生理学的静止膜電位に近いマイナス70ミリボルトに変更します。
次に、マイクロピペットに一時的かつ穏やかな吸引を加えて膜を破裂させ、良好な全細胞構成を作成します。静止膜電位で25ピコアンペア増分で25〜150ピコアンペアの一連の1秒間の脱分極電流パルスを使用して、電流クランプ内の各ニューロンの発火パターンをテストすることにより、発火特性を記録します。