JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 4:35 分 • July 8th, 2025
暗室の記録室内の暗に適応したマウスの網膜スライスを取ります。網膜は、カバースリップの上にセットされた支持力のある人工ベースの上に座っています。スライスをaCSFで灌流します。
網膜ニューラルネットワークには、神経節細胞とシナプスを結ぶ双極細胞にシナプス的に結合した光受容体が含まれます。
記録ピペットを網膜の近くに置きます。
顕微鏡下で、標的神経節細胞に近づきながら陽圧を加えます。
陰圧に切り替えて膜パッチを引き寄せ、それを破裂させて細胞質との連続性を確立します。
暗闇の中では、光受容体膜は脱分極したままで、神経伝達物質の放出につながります。
双極細胞受容体に結合する神経伝達物質は、陽イオンチャネルの閉鎖を引き起こし、シグナル伝達を阻害します。
光パルスを印加して光受容体を過分極させます。神経伝達物質の放出が減少すると、双極細胞の陽イオンチャネルの開放が引き起こされます。
陽イオンの流入は神経節細胞受容体に結合する神経伝達物質の放出を誘導し、ピペットによって記録された興奮性シナプス後電位を生成します。
パッチクランプ記録の場合は、灌流チューブにエイムズ培地をプライミングし、すべての気泡をチューブから通過させます。ガラスプーラーで記録ピペットを作った後、チップにピペット溶液を埋め戻します。次に、マイクロピペットフィラーを使用してピペットの約3分の1を充填します。充填したら、各ピペットを湿らせたピペットボックスに保管します。
次に、コンピューター、アンプ、CCD カメラ、顕微鏡などのパッチ クランプ記録用の機器の電源を入れます。暗い場所で作業し、赤外線ビューアを使用して網膜スライス調製物を顕微鏡ステージに配置します。固定化した後、継続的な灌流を開始します。
灌流温度を摂氏33〜37度に設定します。CCDカメラでスライス面を表示します。標的細胞型が存在する標的の位置に焦点を合わせます。パッチクランプ記録のために健康に見える細胞を選択します。健康な細胞が特定されたら、記録ピペットをピペットホルダーに入れ、ピペットをスライス調製に進めます。
スライスの準備に近づいたら、顕微鏡でピペットの先端を見つけます。ピペットチップが顕微鏡下で見えたら、チップをターゲットセルに向かって下に動かします。次に、アンプをセットし、ピペットをナノアンペアあたり5ボルトのピコアンペアに調整します。約5ミリボルトと約10ヘルツの連続電気パルスを2回開始し、ピペット抵抗を確認します。
理想的な抵抗は、ほとんどの網膜ニューロンで5〜12メガオームです。準備ができたら、マウスピースまたはシリンジを使用して、ピペットの先端が標的細胞の表面に来るまで、内部溶液を吹き飛ばします。陽圧が細胞表面に小さなくぼみを作ったら、先端を少し進めて吹き飛ばすのを止めます。
ピペットの抵抗が継続的に増加している場合は、ピペットの抵抗を放置し、1ギガオームを超えるまで抵抗を監視します。抵抗が自然に増加しない場合は、ギガシールになるまで負圧をそっと加えます。ギガシールが達成されたら、保持電位を負の70ミリボルトに変更します。
次に、断続的に負圧を加えて、ピペットチップ内の膜を破裂させます。全セル構成を行うと、ピペットの抵抗は500メガオームから1ギガオームの間ですことができ、容量性電流が観察できます。負の80〜40ミリボルトのI-V関係を記録します。セルの種類に応じて、さまざまなタイプの電圧依存性チャネルが活性化されます。最後に、光誘発シナプス電流または電圧を記録します。