動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用
2011年7月28日
メソッドは、個別に、選択した操作、および回転するディスクの顕微鏡に結合される光トラップを使用して画像ライブの病原体に記述されています。光トラップは、生物の空間的、時間的な制御を提供し、宿主細胞にそれらが隣接して配置されます。蛍光顕微鏡は、細胞への最小限の摂動で動的な細胞間相互作用をキャプチャします。
次の実験の全体的な目標は、光トラッピングとスピニングディスク共焦点顕微鏡を組み合わせて、宿主病原体の相互作用をリアルタイムで観察することです。これは、最初に目的の病原体をチャンバー付きカバーガラスに加えることによって達成されます。次に、粒子が選択され、光学トラップで捕捉されます。
最後に、粒子は目的の細胞に向けられます。ここに示すように。光トラッピングは、動的な細胞内相互作用を観察するために2つの粒子を制御するための効果的な方法です。
この方法は、宿主細胞と病原体との間の空間的関係の完全な制御が得られた場合、食作用にどのような影響があるか、食細胞が取り込む病原体の順序がpha somalの成熟に影響を与えるかどうかなど、感染症および免疫学の分野における宿主病原体の相互作用における重要な質問に答えることができます。一般に、この方法に不慣れな個体は、トラッピング条件を異なる細胞やビーズタイプに最適化する必要があるため、苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、回転するディスクをセットアップして統合するプロセスとして重要です。
光トラップへの共焦点は、すべての光学部品に必要な正確な位置合わせのため、概念化が困難です。目的の病原体を収穫します。例えば、ここでは、ブロスで一晩育てた300マイクロリットルのカナダアルビカンスを培養物から取り出し、病原体を1.5ミリリットルの反応チューブに移します。
次に、病原体を室温で約1300Gで5分間3回洗浄し、上清を吸引し、ペレットを邪魔せずに放置するたびにPBSを再懸濁して超音波処理します。3回目の洗浄後、ペレットを500マイクロリットルのPBSに懸濁します。次に、1ミリグラムのエントラストの染料を100マイクロリットルのジメチルホルムアミドに溶解し、最終濃度が1ミリグラム/ミリリットルになります。
次に、洗浄した病原体を含む反応チューブに3マイクロリットルの染料混合物を加えます。染料は感光性であるため、チューブの周りにホイルを置き、サンプルを摂氏37度で1時間振とうした後、前と同じようにPBSでサンプルをペレット化して洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを300マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
温かいメディアtryinとPVSをウォーターバスウォッシュで摂氏37度まで。生の2、6、4、0.7マクロファージを2回コーティングした10cmの組織培養プレートで、各洗浄の間にPBSを吸引するPBSを添加します。次に、プレート表面を5ミリリットルのトリプシンで覆い、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、プレートの側面をそっとたたき、細胞をプレート表面から取り外します。プレートの外側にトリプシンを飛沫させないように注意してください。次に、プレートに5ミリリットルの培地を追加し、混合物を反応チューブに移します。
ペレット化後、細胞はペレットを乱さないように注意しながら培地を吸引し、ペレットを10ミリリットルの培地に再懸濁します。チャンバースライドの各チャンバーに400マイクロリットルの培地を追加し、次に各チャンバーに5マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。細胞を摂氏37度のインキュベーターで一晩成長させ、5%CO2
で成長させます。インキュベーターピペットからチャンバースライドを取り出し、以前に調製した蛍光標識された目的の病原体をマクロファージの各チャンバーに5〜10マイクロリットル取り出します。マクロファージと病原体は、チャンバーの底に触れて付着したマクロファージを乱さないように注意しながら、ピペッティングで上下させて十分に混合します。スピニングディスク共焦点顕微鏡のすべてのコンポーネントの電源を入れます。
油浸対物レンズに油を加えて顕微鏡を準備します。チャンバースライドを専用ステージに挿入し、DICイメージング用のチャンバースライドアライメント顕微鏡の上部を取り外します。オプティカルトラップとIRレーザーのシャッターをONにします。
次に、レーザーのシャッターを光学トラップに開きます。IRレーザーの前にあるシャッターが閉まっているか、IRカードで確認してください。次に、接着したスライド上のマクロファージに焦点を当てます。
次に、マクロファージに隣接する溶液中に自由に浮遊している病原体を見つけます。この手順で最も難しいのは、サンプルチャンバー内のカバーガラスと対象物との間の接着力により、サンプルチャンバー内で追跡する適切な対象物を見つけることです。そのオブジェクトを動かすには、オブジェクトがトラフィックレーザーによって保持されている間にステージを移動する必要があり、ステージの抗力がトラップによる最大トラップ力を超えないように、ステージを十分に遅い位置で移動する必要があることに注意することも重要です。
病原体がトラップの近くに来るようにステージを動かします。次に、シャッターを開き、トラップを作動させます。サンプルを移動させて、マクロファージを静止したトラップされた病原体画像に接触させます。
DIC蛍光またはカナダのアルビカンスの両方の別々の集団の組み合わせでスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用した病原体(通常は約5ミクロンのサイズ)を、緑、青、赤で標識しました。イメージングを説明するために、1匹のCアルビカンスを捕獲し、灰色の矢印で示されているように他の酵母のクラスターを正方形のパターンで移動させ、混雑した環境でもオペレーターが選択した単一の病原体の特定の位置を捕捉して操作する能力を示しています。この図の病原性生物が示すさまざまな形状形態を捕捉するこのシステムの柔軟性をさらに示すために、光ピンセットを使用して、Cアルビカンス粒子を疑似ハイフィーで保持および位置付けました。
Cアルビカンスは赤色の色素で標識され、白い矢印で囲まれた軌道に沿って移動し、蛍光GFPL C3生細胞の隣に配置されます。緑色です。アルビカンスの酵母部分は、疑似ハイフィーが引きずり下ろされるにつれて閉じ込められました。
Aspergillus fum Goddesは、この特定の細胞株と病原体による食作用の絶対的な時間枠を分析するために、生のマウスマクロファージ細胞の隣にも配置されました。この図では、明るい視野の画像は、白い矢印で示されているように、閉じ込められたアスペルギルスが赤い矢印で示されているように、パスに沿って移動および配置された方法を示しています。閉じ込められた病原体は、トラップが生物を焦点面よりわずかに上に押し出すため、わずかに焦点が合っていません。
アスペルギルスは、目的の生細胞に隣接して配置されるまで移動しました。病原体が細胞に接触すると、トラップはオフになりました。食作用プロセスを活性化し、その後の細胞イベントを観察するためにタイムラプスイメージングを採用しました。
30秒後、生細胞の膜が変化し始め、粒子の周りにカップが形成されました。60秒でカップは完全に形成されました。90秒から150秒の間に、アフ・ゴッティはなり、飲み込まれ、180秒までに粒子は完全に内在化した。
このビデオを見た後、スピニングディスク光トラップ装置を作成する方法、およびそのような装置が生細胞イメージングのための病原体を非侵襲的に制御する方法についてよく理解しているはずです。この技術は、宿主病原体相互作用の分野の研究者が、宿主細胞と病原体との間の空間的関係の役割と、その後の免疫応答に対するその役割を調査する道を開きました。
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概要
この記事では、光学トラッピングとスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて、宿主細胞と病原体の生体間相互作用を観察する方法について説明します。この技術により、病原体の正確な操作とリアルタイムでのイメージングが可能となり、細胞間相互作用のダイナミックな研究ができます。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
背景
- 宿主と病原体の相互作用を理解することは治療戦略を開発する上で重要です。
- 従来のイメージング方法は細胞プロセスを乱す可能性があります。
- 光学トラッピングは生きた細胞を操作するための非侵襲的なアプローチを提供します。
- スピニングディスク共焦点顕微鏡は高速イメージング機能を提供します。
研究目的
- 宿主細胞と病原体の相互作用のリアルタイム観察の方法を開発すること。
- 病原体の位置決めの正確な制御に光学トラッピングを利用すること。
- イメージング中に細胞への撹乱を最小限に抑えること。
使用方法
- 病原体をチャンバー付きカバーグラスに導入します。
- 光学トラッピングを使用して個々の病原体を選択し、捕捉します。
- トラップされた病原体を特定の宿主細胞に誘導します。
- 蛍光顕微鏡で最小限の撹乱で相互作用を捉えます。
主要な結果
- 宿主細胞に隣接する病原体の操作に成功しました。
- 病原体と宿主細胞の間のダイナミックな相互作用を視覚化しました。
- この方法により細胞内プロセスの詳細な観察が可能になりました。
- イメージング中に宿主細胞への撹乱を最小限に抑えました。
結論
- 光学トラッピングとスピニングディスク顕微鏡の組み合わせは、生きた細胞の相互作用を研究するのに効果的です。
- この方法により、リアルタイムでの病原体の挙動の理解を深めることができます。
- 将来の応用には治療法の開発や細胞応答の研究が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Precise manipulation of host-pathogen interactions using optical trapping and live cell imaging addresses a critical bottleneck in immunology and infectious disease research. This capability enables direct observation of early immune responses, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in target validation. Integration of spatial and temporal control over cell contact events enhances the translational value of discovery-stage findings for biopharma portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell-pathogen interactions under controlled conditions for mechanistic clarity.
- Supports functional target validation by visualizing phagocytosis and synapse formation in real time.
- Improves predictive confidence by reducing stochastic variability in cell contact events.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated live cell systems for downstream screening workflows.
- Enables reproducible, quantitative imaging of cellular responses to pathogen exposure.
- Supports assay standardization by minimizing perturbation and maximizing control over experimental variables.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro immune cell behavior with disease-relevant pathogen challenges.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by capturing early immune events.
- De-risks translational advancement by enabling detailed analysis of innate and adaptive immune responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven interrogation of host-pathogen dynamics with high spatial and temporal resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on immune cell engagement and phagocytosis mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides time-resolved measurements of cellular events for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant immune responses in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for repeated, standardized interrogation of diverse host-pathogen systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune response studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live cell imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in infectious disease programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune targets and therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, live cell imaging, and confocal microscopy alignment.
- Demands specialized instrumentation and environmental control for physiological relevance.
- Necessitates cross-team standardization of trapping and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types, pathogens, and bead morphologies.
- Optimization of trapping conditions is essential for reproducibility across experimental systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Labeling of Pathogens with Fluorescent Dye
2:52
Preparation of RAW 264.7 Macrophages for Chamber Slides
4:04
Selection and Manipulation of a Pathogen with the Optical Trap
6:18
Representative Images of Pathogen and Immune Cell Interactions After Trapping-Initiated Pathogen:Cell Contact
8:35
Conclusion
