テトロドトキシンおよびテトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルを用いたモノシナプス結合の試験

脳を露出させた固定化されたトランスジェニックハエを含む電気生理学的セットアップから始めます。

テトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルと赤色光感受性チャネルを共発現するシナプス前ニューロンに接続されたシナプス後ニューロン、およびテトロドトキシン感受性ナトリウムチャネルを持つ介在ニューロンの近くに記録マイクロピペットを配置します。

マイクロピペットに穏やかな吸引を加えて、ニューロン膜としっかりと密閉します。

次に、強い吸引力を加えて膜を破壊します。

一定のセルポテンシャルを維持します。介在ニューロンのナトリウムチャネルを遮断し、介在ニューロンからシナプス後ニューロンへの信号伝達を防ぐテトロドトキシンを導入します。

ただし、テトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルは影響を受けず、ナトリウムイオンがシナプス前ニューロンに入ることができます。

赤色光のパルスでハエを照らします。

これにより、光に敏感なチャネルが刺激され、陽イオンが流入してシナプス前ニューロンを活性化できるようになります。

このシナプス前ニューロンは、介在ニューロンを介さずにシナプス後ニューロンに直接信号を伝達し、結果として生じる電気的活動によりモノシナプス接続が確認されます。

リグで、すぐにカルボゲンで泡立った記録生理食塩水で製剤の灌流を開始します。顕微鏡ステージの上に配置された重力供給生理食塩水リザーバーを使用します。廃生理食塩水を回収するには、2リットルのフラスコに真空ラインを使用します。

次に、パッチピペットに4マイクロリットルの内部記録溶液をロードし、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けます。次に、アンプのオフセットをゼロにし、テストパルスを供給するようにアンプを設定します。次に、脳の鮮明なビューを得るためにIR斜め照明を調整します。

次に、ピペットに陽圧を加えながら、ピペットでセルに近づきます。セルに接触したら、陽圧を解放してピペットをメンブレンに密閉します。次に、膜の保持電位を-60ミリボルトに設定し、ピペットが細胞膜とギガオームシールを形成する必要があります。保持電流は、低いサブピコアンペアレベルに低下する必要があります。

一定のギガオームシールを得るには、陽圧を保ってピペットを清潔に保ち、細胞に近づくときに組織に当たらないようにしてください。

続行するには、-50〜-60ミリボルトのテストパルスを供給するようにアンプを設定します。テストパルスは、パッチピペットの充電に必要な電流を表す大きな容量性過渡現象を明らかにします。静電容量性過渡現象を除去するには、アンプの容量補償ノブを調整します。

次に、陰圧の短いパルスを適用して細胞膜を破裂させ、細胞全体の構成を取得します。容量性過渡現象の大幅な増加は、成功を示します。保持電流のわずかな増加も観察する必要があります。次に、アンプを電流クランプモードに設定し、セルの電位を-50〜-60ミリボルトに調整します。

保持電位は、それに応じて興奮性または抑制性接続を強調するように調整することができます。接続が確認されたら、生理食塩水の再循環のために生理食塩水灌流を設定します。浴槽内の生理食塩水レベルが安定するようにポンプをセットします。

次に、最終濃度が1マイクロモルになるのに十分なテトロドトキシンをシステムに加えます。これにより、パッチを適用されたニューロンのスパイク活動が停止するはずです。そうでない場合は、テトロドトキシンをシステムに追加します。次に、赤色光の短いパルスを適用して、単シナプス接続である可能性が高いものを活性化します。