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筋肉と神経枝が露出した解剖されたショウジョウバエの幼虫を含むペトリ皿を顕微鏡ステージに置きます。
ペトリ皿内の浴液に参照電極を挿入します。
記録電極に等張溶液を充填します。
マイクロマニピュレーターを使用して、この電極を運動ニューロンによって神経支配される腹筋の上に配置します。
神経伝達物質を含む軸索先端の構造であるシナプスブートンに電極先端を置きます。
自発的な神経伝達物質の放出に対する応答である小型興奮性接合電流またはmEJCを継続的に記録します。
mEJC振幅の正しい範囲は、電極の適切な位置を確認します。
次に、標的の筋肉を神経支配する軸索の近くに刺激電極を配置します。
負圧を加えて軸索を電極内の内側に引っ張ります。
刺激電流を徐々に増やして活動電位を誘導します。
これにより、軸索が神経筋接合部で神経伝達物質を放出し、シナプス電流として記録されます。
準備物を入れたシャーレを顕微鏡ステージに置きます。参照電極を浴槽に挿入します。記録電極にHL3溶液を充填します。10倍の対物レンズの下で、電極を浴槽に浸し、マイクロマニピュレーターを使用して腹部セグメント2、3、または4の筋肉の6と7の上に置きます。
次に、対物レンズを60倍に切り替え、エピフルーセンスまたはDIC光学系のいずれかを使用して関心領域に焦点を合わせます。電極の先端をシナプスブートンの上に置き、過度の圧力がNMJに損傷を与えたり、自発的なシナプス活動の増加を誘発したりする可能性があるため、電極を筋肉に非常に優しく押し付けます。
次に、アンプ、ADボード、コンピューターの電源を入れます。次に、アンプの電圧クランプモードを選択します。取得ソフトウェアを起動し、ギャップフリーモードを選択し、コンピューター画面上のmEJCの外観を観察します。mEJCの振幅が0.2〜0.7ナノアンペアの範囲にあることを確認してください。
視覚制御下でマイクロマニピュレーターを使用して、刺激電極を神経支配する腹部セグメント2〜4の軸索の近くに配置します。電極ホルダーに接続されたシリンジのピストンを引っ張って負圧を加え、軸索が電極の内側に引っ張られるようにします。
次に刺激装置をオンにします。絶縁ユニットのノブを回して電流をゼロに設定し、EJCが表示されるまで、またはスレッショルドに達するまで、電流をゆっくりと増やします。EJC の観察の閾値と比較して刺激電流が約 2 倍増加し、閾値を超える領域で刺激を実行します。