JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 3:34 分 • July 8th, 2025
蛍光標識感覚ニューロンを発現するトランスジェニックマウスから化学感覚鋤鼻器官の冠状スライスを採取します。
感覚上皮にはこれらの標識ニューロンが含まれており、化学的手がかりを感知するために鼻腔に接続された内腔にさらされています。
スライスアンカーを使用して、イメージングチャンバーにスライスを固定します。
チャンバーを記録セットアップに移し、酸素化された細胞外溶液を流して組織の生存率を維持します。
灌流ピペットをスライスの近くに配置して化学刺激を導入し、感覚ニューロンの上に記録ピペットを
配置します。蛍光顕微鏡を使用して、標識されたニューロンを同定します。
ピペットの目詰まりを防ぐために陽圧を加え、膜にくぼみが形成されるまでニューロンに近づきます。
負圧に切り替えて、膜をピペットに引き込みます。
吸引を加えて膜を破裂させ、全細胞パッチクランプと呼ばれる細胞質との連続性を確立し、化学刺激の導入を可能にし、結果として生じる電気生理学的信号を記録します。
VNOスライスをイメージングチャンバーに移し、厚さ0.1mmの合成繊維で配線されたステンレス鋼アンカーを使用してスライス位置を固定します。組織スライスを合成繊維糸で覆わないでください。次に、イメージングチャンバーを記録セットアップに移し、室温でスライスを酸素化S2で連続的にスーパーフュージョンします。
吸引毛細管を溶液の表面に調整して、浴液を一定に交換します。次に、血管を含む VNO スライスの非感覚部分の上と近くで 8-in-1 マルチバレル灌流ペンシルを調整します。その後、150ミリモルの塩化カリウムを充填したL字型寒天ブリッジを使用して、参照電極と浴液を接続します。
続いて、パッチピペットにピペット溶液S4を充填します。ヘッドステージに接続された塩化銀コーティング電極の上に、コーティングをこすり落とさずにピペットを取り付け、しっかりと取り付けます。次に、バスに入る前にパッチピペットにわずかな陽圧を加えます。ピペットを監視し、4メガオームから10メガオームの間にあることを確認します。
赤外線に最適化されたDICを使用してCCDカメラでVNOスライスを視覚化し、FPR-rs3-i-Venus発現細胞、または蛍光照明と適切なフィルターキューブを使用して同様に標識されたニューロンを識別します。感度を最大限に高めるために、ハンドホイールを使用して細胞本体に近づきます。陽圧により、ピペットチップが近接すると、細胞体膜の小さなへこみが見えるようになります。
次に、正圧を解放し、わずかな負圧を加えて細胞膜を吸い込み、1〜20ギガオームの高抵抗シールを得る。続いて、短時間で穏やかな吸引を加えて細胞膜を破壊し、細胞全体の構成を確立します。