マウス脳内皮における細胞内カルシウム電位と膜電位の同時測定

マウスの後大脳動脈のセグメントを取ります。

酵素溶液とインキュベートして組織マトリックスを分解し、細胞を緩めます。

溶液をバッファーに置き換えてから、セグメントを記録チャンバーに移します。

結合組織と平滑筋細胞層を機械的に解離し、下にある内皮管を分離します。

チューブを固定し、解離層を取り除き、生理学的バッファーを追加します。

チャンバーを連続バッファフローのある記録システム内に配置します。

内皮細胞に入る蛍光カルシウム指示薬を導入し、記録電極を細胞に挿入します。

カルシウムイオンの流入を誘発し、小胞体からのカルシウム放出の下流シグナル伝達を誘導する薬

剤を投与する。

指示薬はカルシウムに結合し、励起されると蛍光を発します。

カルシウムの増加は、カルシウム依存性カリウムチャネルを活性化し、カリウムの流出を引き起こし、膜電位を変化させます。

電極を使用して、蛍光シグナルと膜電位を介して細胞内カルシウムの変化を同時に記録します。

この手順では、顕微鏡、カメラ、およびチャンバーとマイクロマニピュレーターを保持するアルミニウムステージを使用して粉砕装置を準備します。ステージと検体に隣接するポンプコントローラーでマイクロシリンジを固定します。次に、粉砕ピペットに鉱物油を完全に埋め戻し、マイクロシリンジピストンの上に固定します。

次に、ポンプコントローラー付きのマイクロシリンジを使用して、気泡がないことを確認しながら、約130ナノリットルの解離溶液をピペットに引き出します。続いて、無傷の動脈セグメントを、10ミリリットルのガラス管に必要な濃度の酵素を含む1ミリリットルの解離溶液に入れます。

部分消化のために摂氏34度で10〜12分間インキュベートします。消化後、酵素溶液を5ミリリットルの新鮮な解離溶液と交換します。1ミリリットルのピペットを使用して、1つのセグメントを室温で解離溶液を含むチャンバーに移します。

次に、ピペットをチャンバー内の解離液に入れ、消化した容器の一端近くに配置します。ポンプコントローラーで毎秒2〜5ナノリットルの範囲内の速度を設定し、穏やかな粉砕を実現します。100倍から200倍の倍率で見ながら、動脈セグメントを引き抜いて排出し、内皮管を作りながら平滑筋細胞を解離させます。

必要に応じて、先端の細い鉗子を慎重に使用して、解離した外膜と内部弾性層を内皮管から分離します。すべての平滑筋細胞が解離し、内皮細胞のみが無傷のチューブとして残っていることを確認します。

マイクロマニピュレーターを使用して、ホウケイ酸ガラスピン留めピペットを使用して、内皮チューブの両端をスーパーフュージョンチャンバーのガラスカバーガラスに固定します。解離した外膜細胞と平滑筋細胞をチャンバーから洗い流し、解離溶液を2ミリモルの塩化カルシウムPSSと交換します。

内皮チューブに固定され