マウス脳内皮における細胞内カルシウム電位と膜電位の同時測定

マウスの後大脳動脈のセグメントを取ります。

酵素溶液とインキュベートして組織マトリックスを分解し、細胞を緩めます。

溶液をバッファーに置き換えてから、セグメントを記録チャンバーに移します。

結合組織と平滑筋細胞層を機械的に解離し、下にある内皮管を分離します。

チューブを固定し、解離層を取り除き、生理学的バッファーを追加します。

チャンバーを連続バッファフローのある記録システム内に配置します。

内皮細胞に入る蛍光カルシウム指示薬を導入し、記録電極を細胞に挿入します。

カルシウムイオンの流入を誘発し、小胞体からのカルシウム放出の下流シグナル伝達を誘導する薬

指示薬はカルシウムに結合し、励起されると蛍光を発します。

カルシウムの増加は、カルシウム依存性カリウムチャネルを活性化し、カリウムの流出を引き起こし、膜電位を変化させます。

電極を使用して、蛍光シグナルと膜電位を介して細胞内カルシウムの変化を同時に記録します。

この手順では、顕微鏡、カメラ、およびチャンバーとマイクロマニピュレーターを保持するアルミニウムステージを使用して粉砕装置を準備します。ステージと検体に隣接するポンプコントローラーでマイクロシリンジを固定します。次に、粉砕ピペットに鉱物油を完全に埋め戻し、マイクロシリンジピストンの上に固定します。

次に、ポンプコントローラー付きのマイクロシリンジを使用して、気泡がないことを確認しながら、約130ナノリットルの解離溶液をピペットに引き出します。続いて、無傷の動脈セグメントを、10ミリリットルのガラス管に必要な濃度の酵素を含む1ミリリットルの解離溶液に入れます。

部分消化のために摂氏34度で10〜12分間インキュベートします。消化後、酵素溶液を5ミリリットルの新鮮な解離溶液と交換します。1ミリリットルのピペットを使用して、1つのセグメントを室温で解離溶液を含むチャンバーに移します。

次に、ピペットをチャンバー内の解離液に入れ、消化した容器の一端近くに配置します。ポンプコントローラーで毎秒2〜5ナノリットルの範囲内の速度を設定し、穏やかな粉砕を実現します。100倍から200倍の倍率で見ながら、動脈セグメントを引き抜いて排出し、内皮管を作りながら平滑筋細胞を解離させます。

必要に応じて、先端の細い鉗子を慎重に使用して、解離した外膜と内部弾性層を内皮管から分離します。すべての平滑筋細胞が解離し、内皮細胞のみが無傷のチューブとして残っていることを確認します。

マイクロマニピュレーターを使用して、ホウケイ酸ガラスピン留めピペットを使用して、内皮チューブの両端をスーパーフュージョンチャンバーのガラスカバーガラスに固定します。解離した外膜細胞と平滑筋細胞をチャンバーから洗い流し、解離溶液を2ミリモルの塩化カルシウムPSSと交換します。

内皮チューブに固定された移動式プラットフォームを、超融合および実験装置の顕微鏡に移します。次に、実験中にPSSとそれぞれの薬物溶液を連続送達するために、6つの清潔な50ミリリットルリザーバーを使用します。

インライン流量制御バルブを使用して、流量供給と真空吸引を一致させながら、流量を層流と同じくらい一貫して手動で設定します。バックグラウンドデータと色素の負荷を記録する前に、内皮チューブの過融合のために少なくとも5分間PSSをチャンバーに送ります。

細胞内カルシウム濃度と同時に膜電位を測定するには、鋭利な電極を引っ張り、2モルの塩化カリウムを埋め戻して、Fura-2色素をロードした細胞から記録します。

色素転写による細胞間カップリングを研究するには、2モルの塩化カリウムに溶解した0.1%ヨウ化プロピジウムを微小電極に埋め戻します。次に、マイクロマニピュレーターで固定された電位計ヘッドステージに取り付けられたピペットホルダー内の塩化物でコーティングされた銀線の上に電極を置きます。

マイクロマニピュレーターを使用して、4倍の対物レンズを通して見ながら、電極の先端をチャンバー内の流れるPSSに短時間配置します。続いて、接地された浴の電位と一致するように、静止膜電位をゼロに設定します。

必要に応じて、電位計にリンクされた可聴ベースラインモニターを使用して、音のピッチを潜在的な録音に関連付けます。その後、40倍の対物レンズを使用して倍率を400倍に上げ、電極の先端を内皮管の細胞のすぐ上に配置します。

測光ソフトウェアを使用して測光ウィンドウを調整し、約50〜80個の内皮細胞に焦点を合わせます。次に、マイクロマニピュレーターを使用して電極を内皮管の細胞の1つにそっと配置し、静止膜電位が安定するまで少なくとも2分間待ちます。

静止膜電位が期待値で安定したら、光がない状態で蛍光界面上の光電子増倍管をオンにし、510ナノメートルで蛍光発光を収集しながら、340ナノメートルと380ナノメートルでFura-2を交互に励起して細胞内カルシウム濃度の取得を開始します。

膜電位と細胞内カルシウム濃度の同時測定が確立されたら、薬物を適用する前に、内皮管とPSSの超融合を一定の層流で約5分間待ちます。

PSSで調製した薬剤を一定の流量で超融合チャンバーに塗布します。薬物治療中は、F340/F380比の膜電位を同時に測定します。実験が終わったら、電極をセルから引き抜きます。次に、膜電位と細胞内カルシウム濃度のそれぞれの記録を停止し、データ分析のためにファイルを保存します。