電気生理学的記録を用いた共培養における神経接続形成の評価

酸素化された細胞外溶液で灌流された記録チャンバーに、共培養を含むカバーガラスを置きます。

共培養は、星状細胞、蛍光タンパク質に融合した光感受性イオンチャネルを発現するラット皮質ニューロン、および別の蛍光タンパク質を発現するiPS細胞由来のニューロンで構成されています。

共焦点顕微鏡を使用して、蛍光iPS細胞由来のニューロンを同定します。

細胞内溶液で満たされた記録ピペットをニューロンに向かって進めて、全細胞構成を確立します。

正確な電流測定のために、一定の負の膜電位を維持します。

共培養を光で照らして、皮質ニューロンの光感受性イオンチャネルを活性化し、それによって活動電位を生成します。

活動電位は、シナプス間隙への神経伝達物質の放出を引き起こします。

シナプスで接続されている場合、神経伝達物質はパッチされたiPS細胞由来ニューロンの受容体に結合し、イオンチャネルを開き、シナプス後電流を生成します。

光刺激後のiPS細胞由来ニューロンにおけるシナプス後電流の増加は、皮質ニューロンとのシナプス接続を確認します。

60倍の水浸レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用してください。室温で細胞を外部溶液に灌流し、95%の酸素、5%の二酸化炭素で絶えず泡立てます。内部溶液を使用して、記録マイクロピペットを充填します。

光遺伝学的刺激を実行するには、tdTomato陽性細胞を全細胞モードでパッチし、電圧クランプを負の70ミリボルトに設定します。全磁場水銀ランプと480-over-40励起フィルターで、全磁場を30秒間刺激します。ChR2発現シナプス前皮質ニューロンの光刺激によって誘導されたパッチ細胞のシナプス後電流(PSC)を記録します。