シナプス共培養における腹側海馬軸索に沿ったニコチン誘発性カルシウムシグナル伝達のイメージング

マウス腹側海馬スライスと側坐核ニューロンの遺伝子組み換え共培養物をカバーガラスに載せて取ります。

海馬ニューロンは、ニコチン性アセチルコリン受容体を過剰発現するシナプス前軸索終末を投影し、シナプス後側坐核ニューロンとシナプスを形成します。

ニューロンには、細胞内カルシウム測定用のカルシウム指示色素がロードされています。

カバーガラスを、カルシウムイオンを含むバッファーを灌流した共焦点顕微鏡チャンバーに移します。

海馬軸索突起の蛍光画像をコントロールとしてキャプチャします。

海馬ニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体に結合し、カルシウム流入を引き起こすニコチンを灌流します。

カルシウムイオンは細胞内色素に結合し、蛍光を増加させます。

海馬軸索は興奮性神経伝達物質を放出し、側坐核ニューロンのシナプス伝達を開始します。

ニコチンを除去するためにバッファーで洗浄します。

時間が経つにつれて、ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化により細胞内貯蔵庫からのカルシウム放出が引き起こされ、色素蛍光の増加につながり、腹側海馬軸索に沿ったカルシウムシグナル伝達が持続していることを示します。

培養物を一度に1つずつイメージングチャンバーに移します。プレニコチンコントロールとして、腹側海馬マイクロスライスからの軸索突起のベースライン蛍光色素画像を収集します。

次に、1マイクロモルのニコチンを毎分2ミリリットルの急速灌流で1分間塗布し、HBSカクテルでニコチンを洗い流します。ニコチン適用前、最中、後に10秒ごとに30分間、タイムラプス画像をキャプチャし続けます。