根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

この手順の全体的な目標は、脊髄根損傷後に有意な再生を誘発する手段を発見するために、後根再生を調査することです。これは、最初に右のL型5背根を露出させ、脊髄と背根のYFP標識陽性軸索の視覚化を可能にする脊髄半身椎弓切除術を作成することによって達成されます。次に、Lの5つの背根を丁寧に潰し、出血を最小限にします。

次に、破砕後に破砕部位を画像化して、損傷した背根の病変部の位置を確認します。いくつかの時点の過程で、損傷部位と後根エントリーゾーンが画像化され、損傷した軸索が脊髄に再生する能力が決定されます。最終的には、再生する軸索が急速に固定化され、後根エントリーゾーンまたはDREZに入るときに静止したままであることを示す結果を得ることができます。

この技術の主な利点は、死んだ動物でのイメージングなどの既存の技術よりも優れている点は、このシステムを生きた動物で数週間または数か月にわたって繰り返しイメージングできることです。まず、サーモスタット制御の加熱パッドを蛍光実体顕微鏡の下に置き、加熱パッド上で出力を摂氏32.5度に調整し、摂氏32.5度に調整します 脊髄の灌漑のために摂氏32.5度に予熱滅菌リンガー溶液 手術中に、キシラジンとケタミンカクテルの腹腔内注射で動物を麻酔します。鎮痛剤ブプレノルフィンの初期用量も皮下投与されます。.

適切なレベルの麻酔は、触知可能な反射がなく、動物がつま先のつま先に反応しない場合に達成されます。麻酔が確認されたら、小さな動物用バリカンで背中の上部を剃り、綿棒で剃毛部分に脱毛ローションを1滴垂らします。数分後、塗布したローションと残っている毛皮を石鹸水で取り除きます。

最後に、70%エタノールを浸したガーゼスポンジを使用して、手術野を完全に洗浄します。動物を加熱パッドの上に置き、70%エタノールに浸した綿棒で皮膚を消毒します。滅菌外科用ドレープは、デモンストレーションの目的で適用する必要があります。

このビデオには含まれていません。実体顕微鏡の明視野照明下で、背中の皮膚に2〜3センチメートルの正中線切開を行います。必要に応じて、綿の先端の綿棒を使用して出血を止めます。

細い鉗子と骨の顎で脊椎の筋肉組織を反映します。下にある腰椎を露出させるため。小さな r 陪審員を使用して右側半身椎弓切除術により L 3 から S 1 の脊椎セグメントを露出させ、次に温かい滅菌リンガー溶液で空洞を灌流します。

動物を巻いた綿ガーゼで作られたサポートクッションの上に置きます。脊柱を平らにします。リトラクションフックを使用して、露出した領域を広げます。

この時点で、麻酔薬の最初の注射から約30分後に、動物を完全に麻酔をかけ続けるためにサプリメントを注射する必要があります。蛍光励起に切り替えて、FPが軸索を標識した理由を視覚化します。27.5ゲージの針の先端を使用して、Lの5つの背根灌流を覆う硬膜に小さな切開をリンガー溶液で繰り返し行い、綿の先端の綿棒で優しくきれいにします。

破砕する部位を特定し、露出した損傷を受けていない領域全体の画像を撮影します。これは、その後のイメージングセッションで損傷部位を特定するのに役立ちます。次に、細い鉗子の片側を挿入します。

鉗子を静かに、しかししっかりとLの5つの根の内側部分を10秒間保持して正しく閉じてから、鉗子を静かに放します。生理液で繰り返し洗い、綿棒でやさしくきれいにします。低倍率と高倍率の両方で、クラッシュサイトとクラッシュ前後のDREZを含む、露光領域全体の複数の画像を取得します。

しっかりとイメージングした後、露出した脊髄の上に薄い合成マトリックス膜を塗布し、続いて人工硬膜を塗布し、露出した脊髄窓に正確に収まるようにします。滅菌済みの5つのOH縫合糸で筋肉組織を閉じ、創傷クリップで正中線切開を閉じます。リンゲル溶液を皮下に注射し、術後鎮痛剤としてブプレノルフィンを 12 時間ごとに 2 日間筋肉内注射で投与します。

前述のようにキシラジンとケタミンで動物に麻酔をかけ、創傷クリップと縫合糸を取り除きます。人工硬膜と薄い合成マトリックスメンブレンパッチを取り外し、後で再利用するためにリンガー溶液を含む滅菌チューブに保管します。次に、26ゲージの針の曲げた先端と、温かいリンガー溶液で頻繁に灌流する細い鉗子で、蓄積した結合瘢痕組織を優しく取り除きます。

クラッシュサイトや後根エントリーゾーンなどの術野を再露出し、前のセッションで画像化されたYFP標識軸索を再配置して、再生中のイメージングを継続します。ここでは、色付きの矢印で示されている4つの表面的なYFP標識軸索が、クラッシュの直後に示されています。クラッシュの3日後、4つの軸索すべてが1つの神経突起を伸ばし、クラッシュの5日後2日で強調表示されているように、クラッシュサイトを通じて成長します。

神経突起は安定しており、これらの軸索または他の近位軸索からの追加の成長はありません。4日目には、再生する神経突起は、温存された軸索よりも薄く、薄暗いです。これらの軸索の先端を2〜3日ごとにさらに2週間繰り返し画像化すると、これらの軸索は前方に成長したり収縮したりせず、一部の軸索の先端とシャフトの腫れとともに動かないままであることがわかります。

このビデオを見た後、軸索再生を禁止または促進するメカニズムをよりよく理解するために、L 5 do根を露出、粉砕、および観察する方法を十分に理解しているはずです。