Name: 根切断術後の後根の軸索のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ脊髄根損傷後の軸索再生メカニズムをthy1-YFPトランスジェニックマウスを用いたライブイメージングで。蛍光顕微鏡により4週間以上にわたり軸索の動態を追跡し、背根進入帯での再生過程を可視化する手法です。

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我々は、コメントと編集のヘルプは博士アランテスラーに感謝。この作品は、NIH NS062320によってサポートされていました。

1。セットアップ顕微鏡とイメージングの準備<ol><li>私たちのイメージングセットまでは、高速シャッターとMetamorphソフトウェアによって制御される冷却CCDカメラとライカMZ16蛍光実体顕微鏡で構成されています。 </li><li> ° C、動物の体温の間に、次の手術を維持するために、サーモスタット制御の加熱パッドを準備し、32.5に出力を調整します。 </li><li> 32.5℃まで手術中の脊髄の灌漑のための事前に暖かい滅菌リンゲル液または人工脳脊髄液（ACSF）。 </li><li>キシラジン（8 mg / kgの）とケタミン（120 mg / kg）のカクテルの腹腔内注射で動物を麻酔。 </li><li>小動物のバリカンで背中を剃ると綿棒で剃毛面積以上の脱毛ローションの小さなドロップを広げる。分後、70％エタノールに浸したガーゼのスポンジを使用して適用ローションを削除します。 </li></ol> 2。椎弓切除およびL5背根の外科的露出<ol><li>温水（32.5 ° C）パッドの上に動物を配置し、70％エタノールに浸した綿棒で皮膚を消毒する。 </li><li>背中の皮膚に - 実体顕微鏡で明視野照明の下、正中切開（3センチ〜2）を実行。必要に応じて、出血を止めるために綿棒を使用してください。 </li><li>基本的な腰椎を公開するために脊髄の筋肉組織を反映している。 </li><li>右両面半椎弓切除は、小さなrongeursを使用してL3 - S1脊髄セグメントを公開。腰仙骨脊髄の4-6セグメントを露出部分椎弓切除は、L2椎骨（2吻方腰の腸骨稜のレベル（L5 DRGの位置）でL5椎の右側の背の部分を削除して作成され最後の肋骨の椎尾）。暖かい滅菌リンゲル液で空洞を灌流。 </li><li>脊柱をフラット化するサポートクッション（圧延コットンガーゼ）に動物を配置します。露出面積を広くするために撤回のフックを使用してください。 </li><li>この時点で（麻酔の最初のIP注射、サプリメント（0.5X）後約30分、動物は完全に麻酔を維持するために皮下注射する必要があります。代わりに、ガス麻酔（2から4パーセント0.5L/min酸素のイソフルラン）1時間以上の撮像セッション中に繰り返し麻酔のために使用することができます。 </li></ol> 3。根切断術/後根粉砕<ol><li> YFP標識された（+）軸索を可視化する蛍光励起に切り替えます。 </li><li>サブQ（26ga.）針の先端を使用して、L5後根（DR）を覆う硬膜に小切開を行います。リンゲル液で繰り返し灌流と綿棒で軽く清掃。 </li><li>押しつぶされるようにサイトを識別し、微細な鉗子（デュモン＃5）subdurallyの片側を挿入する。 </li><li> 10秒間L5ルートの内側部を保持し、慎重に、しっかりと鉗子を閉じて、静かにピンセットを離します。 </li><li>生理的溶液で繰り返し洗浄し、綿棒で軽く清掃。 </li></ol> 4。画像取得と術後の手続き<ol><li>前と右の両方が低いと高倍率でのクラッシュ後のクラッシュのサイトとDREZを含む全体の露出した領域の複数の画像を取得します。 </li><li>画像は、単一のスナップショットとして、または30分以内に取得した10から20フレームの複数のストリームのいずれかとして取得される - 40ミリ秒の露光時間に。合焦画像は選択され、概要モンタージュは、後でPhotoshopを使用して作成されます。 </li><li>瘢痕形成を最小限に抑えるために、しっかりと露出脊髄の上に、人工硬膜に続く細い合成マトリックス膜（Biobrane）の一部を、適用する。彼らは脊髄に付着しているように、露出した脊髄のウィンドウに正確に合うようにピースをカットしてください。 </li><li>無菌5から0縫合糸で筋肉を閉じ、創傷クリップで正中切開を閉じてください。 </li><li>リンゲル液（0.3〜0.5 mLを皮下）注入、および皮下術後鎮痛（0.05 mg / kg）を2日間12時間ごとにブプレノルフィンを投与する。 </li><li>回復するまで加熱パッド（34 ° -35 ° C）に動物を保管してください。 </li></ol> 5。繰り返しイメージング<ol><li>動物を麻酔し、傷のクリップおよび縫合糸を除去。 </li><li>人工硬膜と薄い合成マトリックスの膜のパッチを削除し、後で再利用するためにリンゲル液を含有する滅菌チューブに保管してください。 </li><li>ゆっくりとサブQ針と細かい鉗子の曲がった先端で、蓄積されたすべての結合組織の瘢痕を削除します。暖かいリンゲル液で頻繁に灌流。 </li><li>クラッシュのサイトとDREZ含め、術野を再公開する、以前のセッションで結像されるYFP +軸索を再配置、および第4節で説明した手順を繰り返します。 </li></ol> 6。代表的な結果： 我々は、彼らが切除傷害後の再生成していないのに対し、ほとんどすべてのYFP +軸索は、のサイトを通じて成長、ことを観察したクラッシュ後の3日間による傷害（図1）11。通常、クラッシュ後の次の日、我々は、近位断端軸索と軸索を適切に破損していることが確認さ粉砕、（; 3日目と5例、図1）の遠位同じ軸索の断片化/変性の死にバック変性を認め。いくつかの追加の基準が明確に脇に置いていたまたは負傷から回復していた軸索から再生軸索を区別するために適用されます。これらは以下のとおり（1）再生軸索は、クラッシュのサイトを補充蛍光細胞質に起因する未標識のギャップの狭小化とは対照的に近位と遠位部変性（による挫滅サイトでYFPの非蛍光部分+軸索の展開内容を見る軸索が損傷を）生き残った場合、（2）再生軸索は、あまり明るい蛍光、および傷害を生き残った軸索よりも起伏の非常に薄いです、（3）再生神経突起は薄くなり、軸索の変性蛍光フラグメントよりも薄暗い蛍光灯されるときに通過する（4）存続するか脇に置いて軸索とは対照的に、再生軸索はDREZで停止する;彼らが延長し、（5）対照的に存続または免れる軸索に、再生軸索は絞輪のノードを示していない。図1は、4つの表面的なYFP +直後にクラッシュ後の軸索（;色の矢印A1）を示しています。クラッシュの3日後、すべての4つの軸索は、クラッシュのサイトを通じて成長する（A2）、単一の神経突起を拡張。クラッシュ後の5日は、神経突起が安定していると、これらまたはその他の近位軸索（A3）からの追加の成長はありません。 クラッシュ（約3mm / 2日間）11日以降4日間として変性した軸索（すなわち、神経内膜の管）のはるかに厚いと明るい蛍光フラグメントを通して細長いクラッシュサイトを越え、そして早期にDREZに到着した再生神経突起。これらの軸索とその先端の繰り返しイメージングは​​、2週間以上（図2）に対しては2〜3日間は、彼らが前方に成長したり撤回していなかったことが判明、しかし不動のまま。唯一の顕著な変化は、いくつかの軸索の先端とシャフトの腫れていた。これらの観​​察は、それゆえDREZで再生軸索の驚くほど迅速かつ慢性的な固定化を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：5日間以上後根の粉砕のサイトでL5 DR YFP +軸索の繰り返しイメージング。 L5ルートの内側部は押しつぶさ（赤矢印）と0日目、3、、ときめき後の5上に結像された。クラッシュの面積は、右側のパネル（A1 - A3）で拡大されます。 <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：軸索の繰り返しイメージングがL5ルートのクラッシュ後の20日間DREZに到着した4日目 、三軸索（色付きの矢印は）DREZに到着した。これらの軸索の先端は、同じ場所に残り、7日、9、13、15、および20日に、その後のイメージングセッションで同じような外観を持っている。他の軸索のヒントやランドマーク（アスタリスク）に対して相対的軸索の先端の位置は、撮像セッションの間に軸索を運動性を決定するために使用された。

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li>
<li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li>
<li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li>
<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li>
<li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li>
<li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia%2C+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li>
<li>Maio, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration%3A+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS%2FPNS+border%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

それはその後のイメージングセッションで複数の手術侵襲と麻酔薬の手続きが続く広範囲に軸索の成長を監視するためにかなりの背側椎弓切除を必要とするため、直接生きているマウスのイメージングDR再生は特に困難である。いくつかの戦略は、これらの課題を克服する助け。最初に、成功したイメージングは​​、麻酔や出血の持続期間を最小限に抑えることにより、マウスの死亡率を（約25％）の削減が必要、と細心の術後のケアで。死亡率はまたすぐに挿管や呼吸を中断することなく複数の画像を取得するための高速カメラの速度を許可する設定を使用して減少した。露出コードに傷の蓄積を防止することも不可欠でした。これらのコラーゲン傷跡は、イメージングのセッション間で急速に開発し、硬膜の表面に薄いが不透明な層を形成する。除去は、退屈です画像のセッションを延長し、血管系と軸索の損傷をリスク。傷跡の除去のための効果的な戦略はしっかりと露出コードに付着し、傷跡が膜ではなく、硬膜上に蓄積させた薄いマトリクス膜を適用することでした。ために外科的処置とphotoxicityからアーティファクトによる交絡の影響の可能性がある、我々は、繰り返しイメージングや手術をせず、マウスで軸索のプロファイルを検討...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> HラインTHY1 - YFP（2-4ヶ月齢、雌雄） </td><td>ジャクソン研究所（バーハーバー、ME） </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td>キシラジン（AnaSed注射、滅菌溶液） </td><td>ロイド研究所、（シェナンドア、LA） </td><td> 4811 </td><td> 8 mg / kgを</td></tr><tr><td>ケタミン（塩酸ケタミン注射、USP） </td><td>ホスピーラ社（レイクフォレスト、イリノイ州） </td><td> 2051 </td><td> 120 mg / kgの</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（注射Buprenex）（0.05 mg / kg体重） </td><td>レキットベンキーザーティカルズ社（リッチモンド、バージニア州） </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td>小動物のバリカン</td><td>オスタープロフェッショナル、（マックミンヴィル、テネシー州） </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td>脱毛ローション</td><td>教会＆ドワイト共同（プリンストン、ニュージャージー州） </td><td>ベビーオイルとNairさん</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼのスポンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、（ピッツバーグ、ペンシルバニア州） </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、（ピッツバーグ、ペンシルバニア州） </td><td> 14から960 - 3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 mLのシリンジ</td><td>ベクトン、ディクソンと会社フランクリンレイクス、ニュージャージー州） </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td>皮下（サブQ）針、26ga。 </td><td>ベクトン、ディクソンと会社（フランクリンレイクス、ニュージャージー州） </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td>春のはさみや鉗子</td><td>ファイン科学ツール、（フォスターシティ、カリフォルニア州） </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.5 mmの湾曲したrongeurs </td><td>ファイン科学ツール、（フォスターシティ、カリフォルニア州） </td><td> 16221〜14 </td><td></td></tr><tr><td>乳酸加リンガー液USP </td><td> B. Braunはメディカル株式会社、（アーバイン、カリフォルニア州） </td><td> BBR - L7502 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td> APPファーマシューティカル（シャンバーグ、イリノイ州） </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td>薄い合成マトリックス膜（Biobrane） </td><td> Bertek医薬品、（ウェストバージニア州モーガンタウン） </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td>人工硬膜</td><td>ゴアは、MVPデュラエースの代替、WLゴア＆アソシエイツ、（フラッグスタッフ、アリゾナ州）を排除してください</td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> 5から0絹縫合糸</td><td>エチコン社（サマービル、ニュージャージー州） </td><td> K - 580 </td><td></td></tr><tr><td>創傷クリップ</td><td>パーフェクト - ETSブリュノ、（Burnea、フランス） </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ、（ヴェッツラー、ドイツ） </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>浜松、（ブリッジウォーター、ニュージャージー州） </td><td> ORCA - Rx2の</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラ</td><td>世界精密機器（サラソタ、フロリダ州） </td><td> ATC 1000年</td><td></td></tr><tr><td> Metamorphソフトウェア</td><td> Molecular Devices社、（サニーベール、カリフォルニア州） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>フォトショップ</td><td>アドビシステムズ、サンノゼ、カリフォルニア州</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

脊髄神経根の損傷によって負傷した一次感覚軸索は、慢性的な痛みや永続的な感覚消失につながる、脊髄に再生に失敗する。脊髄への後根（DR）軸索の再生が後根エントリゾーン（DREZ）、CNSとPNSの間の界面で阻止される。神経損傷に関連する複雑な変更は事後解析から推定されているためDREZで再生を防止する分子や細胞のイベントの我々の理解は、部分的に、不完全です。このような軸索再生のようなダイナミックな細胞プロセスは、、最高の各生きている動物の複数の観測値とのリアルタイムイベントをキャプチャするテクニックを研究しています。 生体内で連続的にニューロンを監視するために我々の能力は、光学系およびマウス遺伝子組換えの革新的な技術革新に起因し飛躍的に増加している。 THY1 - GFPトランスジェニックマウスの数行は、神経細胞のサブセットを遺伝的に異なる蛍光色でラベル付けされている、個々の神経細胞がインビボ 1 で撮像される許可。これらのマウスは、筋肉の2-4と5月7日脳のin vivoイメージングのために広く使用されており、静的解析が解決していないことを生理学的メカニズムに新たな洞察を提供している。生きている脊髄の神経細胞のイメージング研究では、ごく最近になって始めている。リヒトマンと彼の同僚は、最初のワイド視野顕微鏡8,9で負傷した脊柱（DC）軸索を追跡することによって、その実現可能性を示した。深くに位置するDCの軸索のin vivoイメージング多光子、ミクログリアと血管はまた10を達成している。過去数年間、我々は広視野顕微鏡とTHY1 - YFPマウスのHのラインを使用してDRの軸索の再生を監視するためのin vivoイメージングに適用することに先駆けて。これらの研究は、DRの軸索は、脊髄11内に再生成が禁止されている理由についての小説仮説に私たちを導いた。 THY1 - YFPマウスのHラインでは、別個のYFP +軸索は、表面的にいくつかの軸索を同時に監視できるようになる、配置されている。我々はDREZに到着DRの軸索がより頸髄よりも腰椎でイメージングされたことを知りました。本報告では、我々は再生成DRの軸索の成功を長期的かつ繰り返しイメージングを確保するために有用な発見したいくつかの戦略を説明します。これらは、繰り返し挿管と呼吸の中断をなくす手術に伴うストレスや瘢痕形成を最小限にし、光毒性なしに高分解能で安定した画像を取り込む方法が挙げられる。

アン<em&gt; in vivoで</em後根の粉砕は、次の一次感覚軸索を監視する&gt;イメージングプロトコルが記述されています。手順は、広視野蛍光顕微鏡とTHY1 - YFPトランスジェニックマウスを利用し、CNSのインタフェースを持つPNSと軸索の相互作用が4cm以上の軸索再生の繰り返しイメージングを可能にする。

脊髄根損傷によって損傷した一次感覚軸索は、脊髄への再神経支配ができず、これが慢性疼痛と永続的な感覚喪失につながります。

本手順の全体的な目的は、脊髄神経根損傷後の大幅な再生を誘導する方法を見出すため、後根の再生を調査することである。まず、脊髄半椎弓切除術を行い、右側L5後根を露出させ、脊髄および後根におけるYFP陽性軸索を可視化できるようにする。次に、出血を最小限に抑えるよう注意しながら、L5後根を慎重に圧挫させる。その後、圧挫部位を撮影し、病変部における損傷した背根の位置を確認します。複数のタイムポイントにわたり、損傷部位と背根進入帯を撮影し、損傷した軸索が脊髄内へ再生する能力を評価します。最終的に、再生した軸索は背根進入帯（DREZ）に進入すると急速に固定され、静止したままであることを示す結果が得られます。死後動物でのイメージングなどの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、生体動物において数週間、あるいは数ヶ月にわたって繰り返しこのシステムをイメージングできることです。まず、恒温制御加熱パッドを蛍光ステレオ顕微鏡の下に設置し、出力を32.5 °Cに調整します。脊髄の灌流に使用するため、滅菌リンガー液を32.5 °Cに予熱しておきます。手術中は、キシラジンとケタミンの混合液を腹腔内投与して動物を麻酔します。また、鎮痛剤であるブプレノルフィンを初回投与量として皮下投与します。触覚反射が消失し、趾（あしゆび）へのピンチ刺激に動物が反応しなくなった時点で、適切な麻酔レベルに達したと判断します。麻酔が確認されたら、小動物用バリカンで背中の上部を剃り、綿棒を用いて除毛剤を少 amount 剃毛部位に塗布します。数分後、塗布した除毛剤と残った被毛を石鹸水で取り除きます。最後に、70% ethanolに浸したガーゼスポンジを使用して手術野を完全に清浄にします。動物をヒーティングパッドの上に置き、70% ethanolに浸した綿棒で皮膚を消毒します。なお、本動画ではデモンストレーションのためですが、滅菌手術ドレープを適用してください。この手順はビデオでは示されていません。実体顕微鏡の明視野照明下で、背中の皮膚の正中線に2〜3 cmの切開を加えます。必要に応じて、綿棒を用いて止血してください。微小ピンセットと骨鉗子を用いて脊髄筋を翻転させ、下層の腰椎を露出させます。小規模なr jurorを用いて右側半椎弓切除を行い、L3からS1の脊髄セグメントを露出させた後、腔内を温かい滅菌リンガー液で灌流します。丸めたコットンガゼで作製したサポートクッションの上に動物を配置します。脊柱を平坦にします。リトラクションフック（開創器）を使用して、露出領域を広げます。この時点で、1回目の麻酔剤投与から約30分後、動物を完全に麻酔状態に保つために追加投与を行います。FPラベルされた軸索を視覚化するため、蛍光励起に切り替えます。27.5ゲージの針の先端を用いて、L5後根上の硬膜に小さな切開を加え、リンゲル液で繰

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Cheah, M., et al.感覚軸索再生のモデルとして、背根神経節注射と背根潰傷傷。J. Vis. Exp.

背根神経節注射と背根挫傷傷を用いたラットの感覚軸索再生のモデル化

出典:Shannonhouse, J., et al.In vivo 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロン集団のカルシウムイメージング。J. Vis. Exp. （2023年).このビデオは、トランスジェニックマウスの後根神経節(DRG)のニューロン活動を監視するためのin...

マウスの無傷の背根神経節におけるニューロン群のin vivoカルシウムイメージング

末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。...

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

GABA作動性シナプス前抑制は、モータと脊髄ネットワークでの感覚信号の統合のための重要な脊髄の強力な阻害のメカニズムです。基礎となる一次求心性の脱分極は、後根電位（DRP）の記録により測定することができる。ここでは、マウスにおけるDRP のインビボ記録する方法を実証する。...

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

私たちは、軸索とミエリンの損傷のダイナミクスをリアルタイムで同時に視覚化するために、2光子励起タイムラプス顕微鏡を利用したプロトコルを提示します。この提案されたプロトコルは、中枢性有髄軸索に影響を与える可能性のある内因性および外因性の両方の要因の研究を可能にします...

アンエクスビボレーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

このプロトコルは、感覚軸索再生を研究するためのモデルとして、ウイルスベクターによる後根神経節(DRG)注射の使用と成体ラットの同時後根挫傷を示しています。このモデルは、感覚軸索再生を促進するための遺伝子治療の使用を調査するのに適しています。...

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

エレクトロポレーションは、興味の遺伝子を細胞に提供する効果的なアプローチです。このアプローチは生体内で成体マウス後根神経節 (DRG)...

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

シングルファイバー記録は、中枢および末梢神経系に適用可能な効果的な電気生理学的手法である。付着した坐骨神経を持つ無傷のDRGの調製と共に、伝導障害のメカニズムが調べられる。両方のプロトコルは、末梢神経系と痛みとの関係の理解を向上させます.

インビボシングルファイバー記録と無傷の後部根神経を用いて伝導障害のメカニズムを調べる

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+...

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

本プロトコルは、体細胞および内臓刺激に対する腰椎-6 DRGニューロンのアンサンブルの応答を測定するためのin...

インビボ体細胞および内臓刺激に対する背根神経節ニューロンの応答のカルシウムイメージング

この研究では、麻酔をかけたマウスでT-DRGを曝露するための外科的操作を示し、 in vivo...

末梢神経刺激研究のためのin vivo胸部背根神経節(DRG)カルシウムイメージングとECG記録

学ぶ脊髄根損傷後の軸索再生メカニズムをthy1-YFPトランスジェニックマウスを用いたライブイメージングで。蛍光顕微鏡により4週間以上にわたり軸索の動態を追跡し、背根進入帯での再生過程を可視化する手法です。

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

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