ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

生きたショウジョウバエ幼虫神経筋製剤をカルシウムフリー生理食塩水を含む記録チャンバーに入れます。

幼虫のニューロンは、光感受性カチオンチャネルを発現します。

蛍光色素を含むカルシウム添加生理食塩水に切り替えます。

色素は、内在化されていない状態では弱い蛍光を発しますが、ニューロンによって内在化されると強く蛍光を発します。

幼虫を青い光で照らします。

これによりチャネルが活性化され、陽イオンの流入とニューロンの脱分極が誘導され、活動電位が開始されます。

活動電位は神経筋接合部のシナプス終末に到達し、カルシウムの流入と小胞のエキソサイトーシスを可能にします。

その後

、色素結合膜は小胞のリサイクル中に内在化されます。

カルシウムフリーの生理食塩水で洗浄して、小胞のリサイクルを止め、内在化していない染料を除去します。

蛍光シグナルを視覚化します。

次に、無色素カルシウム添加生理食塩水を導入し、再度照明します。

これは、別の活動電位、カルシウムの流入、および色素含有小胞エキソサイトーシスを誘発します。

信号をもう一度視覚化します。

小胞エキソサイトーシスによる色素放出は、小胞内在化中の状態と比較して蛍光を減少させます。

チャネルロドプシン刺激の場合は、同軸ケーブルを使用してプログラム可能な刺激装置に青色LEDを取り付け、LEDをカメラポートに配置します。顕微鏡ズーム機能を使用して、FM色素で調製物に青色LED光線を集中させます。

手順のこの時点で最も重要なステップは、LED 設定が一定に保たれていることを確認し、一貫した刺激強度を確保するために、比較するすべての条件で各動物の同じ部分を照らすことです。

光刺激を開始し、光遺伝学的刺激期間の所定の期間タイマーで追跡します。タイマーが止まったら、FM染料溶液を素早く取り除き、カルシウムフリー生理食塩水と交換してSVサイクルを停止します。FM色素のアンロードの場合は、光刺激を開始し、光遺伝学的刺激期間の所定の期間タイマーで追跡します。タイマー期間が終了したら、FM染料溶液をすばやく除去し、カルシウムフリーの生理食塩水と交換してSVサイクルを停止します。