光依存性イオンチャネルを持つ細胞の光遺伝学的電気生理学記録

光依存性イオンチャネルを発現する胚性腎細胞と蛍光レポータータンパク質を含むカバーガラスを、シリコンを塗布した測定チャンバーに置きます。それを閉じて、外部バッファを追加します。

このチャンバーを顕微鏡下に置きます。寒天で満たされた浴電極を置きます。バッファーを灌流して、残留培地と死細胞を除去します。

蛍光フィルターを使用して、標的細胞を特定し、焦点を合わせます。

パッチピペットをマイクロマニピュレーターに取り付けます。詰まりを防ぐために圧力をかけ、セルに近づきます。

ピペットをセルの近くに置き、陽圧を解放して先端に膜パッチを形成します。

膜パッチを形成した後、負圧を加えて膜を破裂させます。

特定の波長の光を照射してイオンチャネルを開きます。イオンの移動は、電極による電圧変化として記録されます。

、測定チャンバーをシリコンで密閉して、外部バッファーの漏れを防ぎます。次に、カバーガラスを1つチャンバーに入れて閉じます。細胞が剥がれないように、チャンバーに細胞外バッファーを慎重に充填します。次に、細胞可視化用の40倍対物レンズを使用して、測定チャンバーを顕微鏡下に置きます。

次に、浴電極の上に寒天ブリッジを置き、液面センサーおよび浴ハンドラーの灌流出口と一緒にチャンバーに入れます。細胞外溶液を1ミリリットルの新鮮な外部溶液と2回交換して、残留培地と剥離した細胞を除去します。細胞に焦点を合わせ、他の細胞から単離する必要があるトランスフェクト細胞を探します。次に、トリプルバンドフィルターセットとオレンジ色のライトを使用して、mCherryを励起し、視覚化します。

ピペットをピペットホルダーに取り付け、チップの目詰まりを防ぐために陽圧を加えます。顕微鏡下でパッチピペットの先端を見つけ、マイクロマニピュレーターを使用して細胞の近くに移動します。

データ収集ソフトウェア内で、Bathモードでメンブレンテストを開始し、電圧ステップを印加します。ピペットの抵抗が1.3〜3.0メガオームの望ましい範囲にあるかどうかを確認します。次に、オフセット電流をゼロにし、アンプのピペットオフセットノブを回してピペット電位を調整します。

全細胞構成でパッチを確立するには、パッチピペットで上からゆっくりとセルに近づき、セルに触れる直前に陽圧を解放します。ピペットの静電容量補償ノブを回して、テストパルスのフラットな応答を得ることで、ピペットの静電容量を補償します。

メンブレンテストをセルモードに切り替えます。次に、強度を増す陰圧または負圧の短いパルスを適用して、シールを破壊することなくパッチを破裂させ、全細胞のコンフォメーションを取得します。

と直列抵抗の2つの全セルパラメータを設定することにより、直列抵抗補償を開始します。さまざまな保持電位で光誘起電流を記録します。この図は、緑色のライトで照らされている間、PSACR1が定常電流レベルに急速に減衰する高速過渡電流を特徴としていることを示しています。