穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

内耳感覚ニューロン細胞体の培養物を記録チャンバーに入れます。

パッチクランプピペットに内部溶液を前面に充填します。

膜穿孔抗生物質を含む同じ溶液を埋め戻し、徐々に先端に到達できるようにします。

ピペットの3分の2に抗生物質溶液を入れ、記録電極を含むホルダーに挿入し、チャンバー内に下げます。

顕微鏡で視覚化してニューロンに近づきます。

ピペットチップがニューロンに接触すると、ニューロン表面にくぼみが形成され、抵抗が増加します。

負圧を加えて、ピペットとメンブレンの間にしっかりと密閉します。

保持電位を静止膜電位に近い位置に維持します。

抗生物質は膜に穴を開け、細胞と電極の間のイオン移動を可能にして安定したイオン環境を確立します。

電圧ステップを適用して電圧依存性イオンチャネルを開き、イオン流入を可能にし、イオンチャネル機能に比例した電流を生成し、電極によって記録されます。

ピペットの先端を培養皿のきれいな溶液に浸し、アムホテリシンを含まないきれいな溶液で満たします。ピペットの背面にアムホテリシンを含む内部溶液を入れます。ピペットの先端を培養皿のきれいな溶液に戻し、アムホテリシンがピペットの背面からゆっくりと先端に入ります。次に、ピペットの2/3までアムホテリシン溶液をピペットに充填し終えます。

ピペットを記録チャンバーの浴槽に下げ、ピペットチップを視野の中央に配置します。チップに気泡やその他の破片がないことを確認してください。ピペットをメンブレンの近くに置き、セルの中心にしっかりと着地させます。注射器またはマウスピペットを使用して負圧または吸引を加えます。

マイナス60ミリボルトの保持電位をオンにします。シール抵抗は、ギガオームを通過するまで増加する必要があります。ギガオームシールが形成されたら、負圧を解放します。アムホテリシンが働き始めます。入力抵抗はゆっくりと減少し、アムホテリシンが膜に入るにつれて、5ミリボルトの電圧ステップに応答して流れる電流は徐々に増加します。