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記録チャンバー内のターゲット領域を含む脳スライスを固定します。
内部溶液を含む記録ピペットをシナプス後ニューロンの上に配置し、全細胞構成を実現します。
シナプス前ニューロンの近くに検索パッチピペットを導入します。
このピペットには、シナプス前細胞を探す際のニューロンの脱分極を防ぐために、ナトリウムベースの溶液が充填されています。
穏やかな吸引を使用して、サーチピペットで緩いシール構成を確立します。
膜電位を保持し、大電流パルスを印加してシナプス前ニューロンの活動電位をトリガーします。
この刺激に対するシナプス後反応を監視します。
反応が検出されない場合は、別のシナプス前ニューロンにパッチを当て、刺激を繰り返します。
シナプス後ニューロンで応答が観察されるまで、このプロセスを続けます。
検索ピペットを記録ピペットに交換し、シナプス前ニューロンに全細胞構成を確立します。
電流パルスを印加してシナプス前ニューロンの活動電位を誘発し、シナプス後応答を記録します。
ターゲット領域のスライスを準備した後、インキュベートします。この間、長くて細いシャンクを持つパッチピペットを引っ張ります。実験室にプラチナハープで脳スライスを固定した後、記録ピペットに内部溶液を満たします。
ピペットをプリアンプに置き、推定シナプス後ニューロンを全細胞モードでパッチします。カリウム塩がナトリウム塩に置き換わった内部溶液で満たされた8〜10メガオームの抵抗のサーチパッチピペットを使用して、サーチピペットに穏やかな吸引を加えて、ルースセル結合構成の潜在的なシナプス前ニューロンにパッチを当てます。
電流クランプモードでは、緩いシールの下の膜電位を負30〜負60ミリボルトに保持します。次に、0.2〜2ナノアンペアの大電流パルスを印加して、潜在的なシナプス前細胞に活動電位を誘発します。
この活動電位を、電圧応答に点灯する小さなスパイクとして観察します。シナプス後反応のランダウンを防ぐために、刺激周波数を0.1ヘルツに設定します。シナプス後ニューロンが、テストされた潜在的にシナプス前ニューロンの刺激に反応しない場合は、新しい潜在的なシナプス前ニューロンをルーズシールモードでパッチします。
この方法で、最大30個のシナプス前ニューロンをテストし、30メガオームを超える抵抗を持つシールを確立できる限り、同じ検索パッチ電極を使用し続けます。
ルーズシールモードでの刺激により、シナプス後ニューロンで潜時が5ミリ秒未満のEPSPまたはIPSPが発生する場合は、シナプス前ニューロンからサーチピペットを取り外します。
抵抗が4〜8メガオームの通常の内部溶液を含むバイオサイトチンで満たされた記録パッチ電極を使用して、シナプス前ニューロンをパッチし、全細胞電流クランプモードで記録します。シナプス前ニューロンへの電流注入により活動電位を誘発し、シナプス後反応を記録します。