Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

固定

化されたラット後根神経節(DRG)を、aCSFで灌流した記録チャンバーに収めます。

DRGには、サテライトグリア細胞に囲まれた感覚ニューロンが含まれています。

細胞内溶液を充填し、増幅器に接続されたパッチピペットに陽圧を加え、標的ニューロンに向かって進めます。

陽圧は、周囲の衛星グリア細胞層を横断し、ニューロンに接触し、その膜にくぼみを形成するのに役立ちます。

負圧を加えてメンブレンと密閉します。

次に、負圧パルスを印加してセル全体の構成を確立します。正確な信号測定のためにアンプパラメータを校正します。

ニューロンの興奮性を決定するには、ニューロンに短い増分電流を印加し、電位依存性イオンチャネルを開き、活動電位をトリガーします。

活動電位をトリガーするために必要な最小電流であるレオベースを測定します。

さらに、ランプ電流を印加して、活動電位が発生する最小膜電位を測定します。

この手順では、劣化を防ぐために電極溶液を氷の上に置きます。次に、ガラスパッチピペットにろ過された細胞内溶液を満たします。次に、ピペットをヘッドステージピペットホルダーに入れます。

ピペットを浴液に下げる前に、プランジャーを約1ミリリットル変位させて、5ミリリットルのシリンジを通してピペットに穏やかな陽圧を加えます。次に、アンプでVクランプモードを選択し、ソフトウェアでメンブレンテストインターフェイスを開きます。

顕微鏡下で、ピペットを標的ニューロンに近づけます。次に、ピペットから陽圧を加えてサテライトグリア細胞層を横断し、ニューロンとサテライトグリア細胞の周囲層との間の空間が突然拡大することが観察されます。次に、ニューロンにくぼみが観察されるまで、ピペットをニューロンに向かって動かし続けます。

私たちの準備では、ニューロンはサテライトグリア細胞に囲まれています。したがって、グリア細胞層に浸透して個々のニューロンに到達するために、記録ピペットは高い陽圧に維持されます。

その後、陽圧を下げます。穏やかな吸引でギガオームのシールを実現します。

全細胞記録構成を得るには、短いが強い吸引によってニューロン細胞膜を貫通します。

または、吸引が加えられている間にアンプのザップ機能を使用します。

全セルモードが確立されたら、アンプの静電容量と抵抗補償ノブを回して、全セルの静電容量と直列抵抗を補償します。次に、メンブレンテストウィンドウを閉じます。Iクランプ アンプのモードノブを回して、通常モードを選択します。

その後、ソフトウェアで [プロトコルを開く] をクリックします。レオベースを測定するためのプロトコルを選択してロードし、[記録]をクリックして記録を開始します。ニューロンの興奮性を調べるには、100ピコアンペアのステップで段階的な一連の脱分極電流を注入することにより、入力抵抗とレオベースを測定