アストロサイト培養物からの細胞表面および細胞内タンパク質の単離

アストロサイト培養を取り、培地を取り除きます。生理学的バッファーを加えて氷上でインキュベートし、細胞表面タンパク質のエンドサイトーシスを阻害します。

細胞表面タンパク質に結合するビオチン化試薬とインキュベートします。

次に、急冷バッファーでインキュベートして、未反応の試薬を不活性化します。

冷たい生理学的バッファーを加え、細胞を機械的に切り離します。細胞を移し、遠心分離して上清を廃棄します。

溶解バッファーとインキュベートして細胞を溶解し、ビオチン化された細胞表面タンパク質と非ビオチン化された細胞内タンパク質を放出します。

遠心分離し、上清を回収し、総タンパク質含有量のある画分を分離します。

残りの画分を、ビオチン化タンパク質に結合するストレプトアビジンでコーティングされたビーズと一緒に攪拌下でインキュベートします。

細胞表面タンパク質結合ビーズをスピンダウンし、細胞内タンパク質を含む上清を分離します。

ズを撹拌下で洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去し、遠心分離して上清を廃棄し、細胞表面タンパク質を単離します。

総タンパク質、細胞内タンパク質、および細胞表面タンパク質を含む画分は、分析の準備が整います。

この手順を開始するには、インキュベーターから星状細胞培養物を取り出し、吸引によって培地を廃棄します。4ミリリットルの冷やしたCM-PBSで細胞を3回洗浄し、砕いた氷の上に皿を置きます。

吸引によってCM-PBSを除去し、次に、2ミリリットルのビオチンバッファーを各ウェルにピペットで入れます。培養物を氷の上に 30 分間置く前に、皿をゆっくりと前後に数回傾けて完全に覆われるようにします。

その後、ビオチン緩衝液を取り出し、4ミリリットルの急冷緩衝液と交換し、培養物を氷上に10分間保持します。次に、培養物を氷上に10分間放置する前に、吸引して同量の急冷バッファーと交換します。

次に、急冷バッファーを廃棄し、4ミリリットルの冷却CM-PBSで細胞を3回洗浄します。これに続いて、細胞を1ミリリットルの冷却CM-PBSに削り取り、懸濁液を微量遠心チューブに移します。

次に、摂氏4度に設定した冷蔵微量遠心分離機で100gで3分間遠心分離して細胞をペレット化します。その後、上清を廃棄し、細胞を500マイクロリットルの溶解バッファーに再懸濁します。

次に、サンプルを氷上に30分間放置し、5分ごとにボルテックスします。その後、ライセートを摂氏4度で10分間14,000 gで遠心分離し、洗剤および可溶性物質をペレット化します。次に、上清を新しい微量遠心チューブに移します。50マイクロリットルのライセートを保存し、25マイクロリットルの3倍ローディングバッファーをそれに加えます。

、乾浴で摂氏95度に加熱して変性させます。これは、ビオチン化細胞表面タンパク質と非ビオチン化細胞質ゾルタンパク質の両方を含むインプット画分です。カットしたピペットチップを使用して、75マイクロリットルのストレプトアビジンアガロースビーズをライセートに移し、摂氏4度でシェーカー上で3時間インキュベートします。

その後、ストレプトアビジンアガロースビーズを1,500gで4°Cで30秒間遠心分離してペレット化します。50マイクロリットルの上清を保存し、25マイクロリットルの3倍ローディングバッファーを追加します。次に、ウォーターバスまたは加熱ブロックで摂氏95度で変性させます。これは細胞内画分を表し、主に非ビオチン化細胞質ゾルタンパク質で構成されています。

その後、ペレット化したビーズを1ミリリットルの洗浄バッファーに再浮遊し、摂氏4度で3分間揺らします。ビーズをペレット化し、上清を捨てます。このプロセスをさらに4回繰り返して、非ビオチン化細胞質ゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えます。

溶解バッファーを使用して1倍に希釈した50マイクロリットルのローディングバッファーを追加します。ビーズを摂氏95度で変性させることにより、ビーズからビオチンとストレプトアビジンを放出します。この画分には、ビオチン化された細胞表面タンパク質のみを含める必要があります。