海馬ニューロンを用いたタンパク質の引力活性または反発活性の評価

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ポートと出口ポートに接続された複数の小さなチャネルを持つシリコンマトリックスを含むディッシュから始めます。

発活性のある試験タンパク質を入口から注入し、チャネルを満たします。

チャネル領域にタンパク質が付着し、テストタンパク質ゾーンを形成してから洗浄するようにインキュベートします。

マトリックスを取り除き、コーティングされた領域に魅力的な活性を持つコントロールタンパク質を重ねて、インキュベートします。

これにより、コントロールタンパク質がテストタンパク質ゾーン間の空の領域に付着しやすくなり、交互の縞模様でコントロールタンパク質ゾーンが作成され、洗浄されます。

ラミニンを加えて縞模様の部分をコーティングし、洗います。

海馬ニューロンの単一細胞懸濁液でコーティングされた領域を播種し、インキュベートします。

テストタンパク質ゾーンでは、ニューロンがタンパク質と相互作用し、ニューロンを反発させるシグナルを引き起こし、それらの付着を阻害します。

対照的に、制御タンパク質ゾーンにおけるニューロンとタンパク質の相互作用はニューロンの付着を促進し、それらの成長と軸索の伸展をサポートします。

蛍光標識組換えタンパク質をPBS中で調製します。ストライプ皿ごとに25マイクロリットルを作ります。混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、各皿について、22ゲージのシリンジに25マイクロリットルの希釈タンパク質を装填し、マトリックスの側面にある小さな穴から注入します。

マトリックスへの気泡の注入は、タンパク質と病気への結合を妨げるため、避けてください。

次に、細胞培養インキュベーターで摂氏37度で30分間皿をインキュベートします。インキュベーション後、300マイクロリットルのPBSを各マトリックスの上部スリットに堆積させます。次に、各マトリックスの側面にある小さな穴からPBSを吸引して、結合していない組換えタンパク質をすべて除去します。タンパク質が乾燥するため、PBSを完全に吸引しないでください。

このPBSすすぎを合計3回実行します。次に、各皿からマトリックスを慎重に取り除きます。次に、すぐに縞模様の領域全体に約100マイクロリットルのコントロールタンパク質を追加し、各皿に交互のコーティングを作成します。

次に、皿を摂氏37度で30分間インキュベートします。一方、氷上で、PBS中のラミニンを1ミリリットルあたり20マイクログラムで解凍します。30分後、PBSで食器を3回洗います。次に、各皿に約100マイクロリットルの冷たいラミニンをコーティングし、皿をインキュベーターにさらに1時間戻します。

1時間後、PBSを使用して皿をもう一度3回洗います。3回目の洗浄後、各皿に約150マイクロリットルの培地を加えます。次に、次に必要になるまで、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターで皿をインキュベートします。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、準備された各ストライププレートで150マイクロリットルの培地で10,000個のニューロンを再生します。ストライプ領域全体を覆うように懸濁液を慎重に堆積します。

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最終更新:1 8月 2026