マイクロ流体チップ内のラット海馬ニューロンの蛍光免疫染色

ラット海馬ニューロンを含むマイクロ流体チップを取ります。

このチップは体細胞と軸索のリザーバーを備えており、コンパートメントはマイクロ溝で区切られており、ニューロンを効果的に区画化し、体細胞領域と軸索領域を分離します。

メディアを取り除き、ホルムアルデヒドを加えます。インキュベートしてニューロンを固定し、その構造を維持します。

余分なホルムアルデヒドを取り除き、緩衝液で洗浄します。次に、ニューロンを透過化するための洗剤を追加します。

界面活性剤をブロッキング溶液に置き換えて、非特異的結合部位をブロックします。

ブロッキング溶液を取り除き、シナプス小胞上の内在膜タンパク質である特定のニューロンシナプスマーカーに結合する一次抗体とインキュベートします。

結合していない抗体を取り除き、バッファーで洗浄します。

シナプスマーカーを標的とする一次抗体に結合する蛍光色素タグ付き二次抗体とインキュベートします。

結合していない二次抗体を除去し、バッファーで洗浄します。

共焦点顕微鏡下でチップを画像化して、蛍光ニューロンシナプスマーカーを視覚化します。

蛍光免疫染色を開始するには、チップからほとんどの培地を取り除き、内部コンパートメントを水分を保ちます。すぐに、軸索および体細胞コンパートメントの上部ウェルに100マイクロリットルの固定溶液を追加します。

1分後、100マイクロリットルの固定液を底のウェルに加え、細胞を室温で30分間固定します。ウェルから溶液の大部分を取り出し、軸索および体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに150マイクロリットルのPBSをすぐに加えます。PBSが下部ウェルに流れ込むまで2分間待ってから、PBSを取り出し、この同じプロセスを使用してウェルをさらに2回すすいでください。

最後のすすぎに続いて、チップのウェルからPBSの大部分を除去し、すぐに軸索および体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに0.25%Triton X-100を含む150マイクロリットルのPBSを追加します。

15分間待ってから、ウェルからほとんどの液体を取り除きます。軸索および体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに150マイクロリットルのブロッキング溶液を直ちに追加します。15分後、ウェルからほとんどの液体を取り出し、すぐに100マイクロリットルの一次抗体溶液を軸索および体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに加えます。

蒸発を最小限に抑えるためにチップを覆い、一次抗体内の細胞を室温で1時間インキュベートします。次に、溶液の大部分を除去してチップをすすぎ、すぐに軸索コンパートメントと体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに150マイクロリットルのPBSを加えます。5分後、両方のウェルからPBSを取り出し、すすぎをさらに2回繰り返します。

次に、ウェルからほとんどの液体を取り出し、軸索コンパートメントと体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれにPBS中の100マイクロリットルの二次抗体をすぐに追加します。蒸発を最小限に抑えるためにチップを覆い、チップを室温で1時間インキュベートします。前に示したように、チップをPBSで3回すすぎます。次に、付属のテキストプロトコルに記載されているように、チップをマウントしてイメージ化します。