脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

非アミロイドタンパク質と不溶性タンパク質凝集体であるアミロイド原線維を含むマウス脳組織抽出物を取ります。

固体スクロースを加えて混合し、溶液の密度を高めます。

それを移し、遠心分離して、より密度の高いタンパク質を破片から分離します。

上清を廃棄し、ペレットを高濃度のスクロース緩衝液に再懸濁し、混合して遠心分離します。

いくつかのアミロイドフィブリルを含む最上層を新鮮なチューブに集め、洗浄バッファーを加えて混合します。

次に、中間層を廃棄し、アミロイド原線維が豊富なペレットを最上層画分を含むチューブに移して、最大限の単離を実現します。

結合した画分を遠心分離し、上清を廃棄します。消化バッファーを加えてインキュベートし、非アミロイドタンパク質のみを分解します。

遠

心分離して上清を除去します。ペレットを洗浄して、残留消化タンパク質を除去します。

残りの非アミロイドタンパク質を可溶化する界面活性剤を含むスクロースベースの可溶化バッファーにペレットを再懸濁します。

遠心分離し、上清を除去し、単離されたアミロイド原線維を再懸濁します。

まず

、6〜8個のセラミックビーズと新たに調製した氷冷均質化バッファーを含む2ミリリットルのチューブに、解剖したばかりの脳組織領域または急速凍結した脳組織領域を配置します。次に、ビーズミルホモジナイザーを使用して4,000RPMで、30秒間のオンとオフパルスの2サイクルで組織を粉砕します。次に、15ミリリットルのチューブ内の1ミリリットルの脳組織ホモジネートに9ミリリットルの氷冷均質化バッファーを加え、実験室のワックスフィルムストリップで密封します。

堅牢な可溶化を確保するには、チューブを摂氏4度で一晩回転させてください。翌日、組織抽出懸濁液に固体スクロースを最終濃度1.2モルまで添加します。よく混ぜて250,000倍gで4°Cで45分間遠心分離します。上清を廃棄した後、1.9モルのスクロースを含む2ミリリットルの均質化バッファーにペレットを粉砕して再懸濁し、摂氏4度で125,000回gで45分間遠心分離します。

遠心分離後、上部の白色固体層を新しいチューブに移し、数回上下にピペッティングして1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーに可溶化します。ペレットにはアミロイド原線維も豊富に含まれているため、水性中間層を廃棄し、ペレットを最上層と組み合わせると収率が向上します。結合した画分を摂氏4度で20分間、8,000倍gで遠心分離します。

上清を廃棄した後、ペレットを1ミリリットルの氷冷消化バッファーに再懸濁し、室温でボルテックス上で3時間インキュベートします。サンプルを再度遠心分離し、次にペレットを1ミリリットルの氷冷トリスバッファーで2回洗浄し、再度遠心分離します。2回目の洗浄後、ペレットを上下にピペッティングして1ミリリットルの可溶化バッファーに再懸濁し、チューブを摂氏4度で60分間200,000倍gで急速に遠心分離します。

ペレットを保存し、上清に50ミリモルのトリス緩衝液を加えることにより、スクロース濃度を1.3モルから1モルに減らします。上清を再度遠心分離し、次に、両方のペレットを0.5%SDSを含む100マイクロリットルのTrisバッファーに溶解します。アミロイド精製のために、超音波を使用してアミロイドに富むペレットを浴超音波装置で20サイクル可溶化します。その後、直ちに材料を20,000倍gで摂氏4度で30分間遠心分離します。

ペ

レットを500マイクロリットルの0.5%SDS Trisバッファーに再懸濁し、さらに4回洗浄を繰り返します。最後の遠心分離ステップの後、ペレットを200マイクロリットルの超純水で洗浄し、摂氏4度で30分間20,000倍gで遠心分離して、残りの洗剤を除去します。精製されたアミロイド原線維を含む最終ペレットを100マイクロリットルの超純水に溶解します。