脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

細胞付着のために、ポリマーでコーティングされた皿に3コンパートメントの培養インサートを固定します。

皿を反転させ、中央のコンパートメントに印を付け、向きを変えます。介在ニューロンを含む培地をこのコンパートメントに追加します。

ヒト脳室周囲内皮細胞(PVEC、脳血管細胞)を含む培地を外側のコンパートメントの1つに加えます。

別の外側のコンパートメントに、コントロールとして非脳室周囲内皮細胞を含む培地を追加します。

ポリマーの乾燥を防ぐために、共培養培地を皿に加えます。細胞接着のためにインキュベートします。

インサートを分解し、各セルタイプ間に小さなセルフリーギャップを持つ長方形のセルパッチを作成します。

共培養培地でリフレッシュし、インキュベートします。

内皮細胞は介在ニューロンを誘発し、無細胞空間に移動します。

一方、PVECは、PVECを含むパッチへの介在ニューロンの移動を促進する化学誘引物質を放出します。

対照細胞パッチよりもPVECパッチへの介在ニューロンの移動が高いことは、PVECからの化学誘引手がかりに対する介在ニューロンの応答を確認します。

化学引力アッセイを実行するには、ポリ-L-オルニチンとラミニンでコーティングされた35ミリメートルの皿の中央に3ウェル培養インサートを置きます。皿を逆さまにし、先端が極細の油性マーカーを使用して、インサートの中央コンパートメントの周りの境界に印を付けます。

中央コンパートメントの70マイクロリットルのニューロン培地に30,000個のGABA作動性介在ニューロンを播種します。次に、10,000個の脳室周囲内皮細胞と10,000個の対照内皮細胞を、2つの外側のコンパートメントにある70マイクロリットルのそれぞれの培地に播種します。

皿の側面に沿って1ミリリットルの共培養培地を加えて、皿のコーティングが乾くのを防ぎます。48時間後、インサートを取り外し、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で36時間インキュベートします。