運動ニューロンライセートからの標的タンパク質-DNA複合体の免疫沈降

DNAに架橋された標的タンパク質に特異的な抗体でコーティングされた前処理された磁気ビーズを含むチューブから始めます。

DNA断片を含む運動ニューロンライセートを加え、撹拌しながらインキュベートします。

DNA断片は抗体でコーティングされたビーズと相互作用し、ビーズ-DNA複合体を形成します。

遠心分離機でキャップから液体を回収し、磁気分離器の上に置いてビーズ-DNA複合体を沈殿させます。

結合していないDNA断片を含む上清を除去します。

界面活性剤ベースの溶解バッファーを導入して、非特異的に結合したDNAフラグメントを可溶化します。

遠心分離して磁気分離を行い、上清を除去します。

非特異的相互作用を破壊するために、高塩緩衝液で洗浄します。遠心分離し、磁気分離を行い、上清を除去します。

LiClバッファーで洗浄して、残りの非特異的相互作用を除去します。遠心分離し、磁気分離を行い、上清を除去します。

最後に、Tris-HClバッファーで洗浄し、遠心分離し、磁気分離を行います。

上清を取り除き、標的タンパク質-DNA複合体を含むビーズを回収します。

クロマチン免疫沈降を開始するには、抗体でコーティングされたビーズを1ミリリットルのブロッキング溶液で洗浄します。抗体でコーティングされたビーズの入ったチューブを摂氏4度のロッキングプラットフォームに5分間置きます。短時間回転させた後、チューブを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。

抗体でコーティングされたビーズを50マイクロリットルのブロッキング溶液に再懸濁します。抗体でコーティングされたビーズに1ミリリットルの超音波処理ライセートを加えます。次に、サンプルを摂氏4度のロッキングプラットフォーム上で一晩インキュベートします。サンプルを一晩インキュベートした後、チューブを短時間回転させてキャップから液体を集めます。次に、チューブを磁気ラックに置き、1分後、ピペットで上清を慎重に取り除きます。

次に、次のように一連の洗浄を行います。CPIを含む1ミリリットルのコールドウォッシュバッファーをサンプルに加えます。サンプルを摂氏4度のロッキングプラットフォームで5分間混合します。サンプルチューブを短く回転させます。次に、磁気ラックに置きます。1分後、ピペットで上清を取り除きます。