小脳オルガノイドスライスの蛍光免疫染色

異なるタイプの小脳ニューロンを含む固定小脳オルガノイド切片を取ります。

切

片をバッファーで洗浄して、残留包埋培地を除去します。

グリシン中でインキュベートして、残留反応部位の固定をブロックし、免疫染色中の非特異的結合を減少させます。

非イオン性界面活性剤を加えて細胞を透過します。

余分な洗剤を取り除き、バッファーで洗浄します。

次に、スライドを乾かします。組織の乾燥を防ぐために、緩衝液を浸した紙で免疫染色皿に移します。

ニューロン上の非特異的部位に結合するブロッキング溶液を塗布します。

ブロッキング溶液を取り除きます。小脳ニューロン内の標的抗原に結合する一次抗体とインキュベートします。

バッファーで洗浄し、結合していない抗体を除去します。

蛍光色素結合二次抗体とインキュベートして、抗原結合一次抗体に結合します。

次に、バッファーで洗浄し、結合していない抗体を除去します。

細胞核を染色するために染料を加えます。

蛍光顕微鏡を使用して、小脳ニューロンに発現するマーカーを視覚化し、オルガノイドの成熟を示します。

オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを50ミリリットルの1X PBSで5分間洗浄します。次に、スライドを新鮮な1X PBSの入ったコプリンジャーに移します。スライドを50ミリリットルの新しく調製したグリシンの入ったコプリンジャーに移し、室温で10分間インキュベートします。

次に、スライドを50ミリリットルの0.1%トリトンを含むコプリンジャーに移し、室温で10分間透過処理します。スライドを1X PBSで毎回5分間2回洗浄します。1X PBSに浸した3ミリメートルの紙で免疫染色皿を準備します。

スライドをスライスの周りにティッシュで乾かし、3ミリメートルの紙の上に置きます。パスツールピペットを使用して、各スライドを0.5ミリリットルのブロッキング溶液で覆います。室温で30分間インキュベートした後、余分なブロッキング溶液を取り除き、スライスの周りにティッシュでスライドを乾燥させます。

各スライドに50マイクロリットルの希釈一次抗体を置き、カバーガラスで覆います。スライドを事前に準備した免疫染色皿に入れ、摂氏4度でインキュベートします。

一晩インキュベートした後、スライドを50ミリリットルのTBSTを入れたコプリンジャーに移し、カバーガラスを剥がし、スライドをTBSTで3回、毎回5分間洗浄します。各スライドに50マイクロリットルの希釈二次抗体を置き、カバーガラスで覆います。

スライドを事前に準備した免疫染色皿に入れます。光から保護された室温で30分間インキュベートします。スライドを再びコプリンジャーに移し、50ミリリットルのTBSTで毎回5分間3回洗浄します。パスツールピペットを使用して、各スライドの表面全体に0.5ミリリットルのDAPI溶液を加え、室温で5分間