JoVE 実験百科事典
神経科学
0 回視聴 • 2:47 分 • July 8th, 2025
神経誘導培地中にヒト脳オルガノイドを含むマルチウェルプレートを取ります。
オルガノイドには、幹細胞、放射状グリア細胞、神経前駆細胞またはNPC、およびロゼットと呼ばれる放射状パターンに配置されたニューロンが含まれており、発達中の脳を模倣しています。
培地を取り出し、オルガノイドを緩衝液で洗浄します。
バッファーに懸濁したジカウイルスをテストウェルに加え、バッファーのみをコントロールウェルに追加します。
インキュベートし、ウイルスがNPC上の受容体に結合して内在化できるようにします。
洗浄して内在化されていないウイルスを除去し、新鮮な神経誘導培地を加えてインキュベートします。
内在化されたウイルスは、宿主細胞機構を使用して新しいウイルス粒子を形成します。
ウイルスの増殖は、アポトーシスを誘導する細胞ストレス応答を引き起こし、オルガノイド発生に利用できるNPCの数を減らします。
時間が経つにつれて、感染したオルガノイドはサイズが小さくなり、形態が破壊され、ジカウイルスに感染した人間の異常な脳の発達を反映しています。
Earleの1Xバランス塩溶液、1XPBS、および神経誘導培地を温水浴で摂氏37度に持ち込みます。次に、既知の濃度のジカウイルスを1X Earleの溶液で、通常0.1〜10の感染の目標多重度に希釈します。P200ピペットを使用して、各オルガノイドウェルからすべての培地を慎重に取り除き、オルガノイドを200マイクロリットルの温かい1X PBSですばやく洗浄します。
各ウェルから培地を取り出すときは、オルガノイドに触れたり、ピペットに吸い込んだりしないことが重要です。これはオルガノイドに取り返しのつかない損傷を与える可能性があります。このような場合は、オルガノイドを廃棄するのが最善です。
次に、シングルチャンネルP200ピペットを使用して、各オルガノイドウェルから残りの液体をすべて慎重に取り除きます。次に、模擬感染用の1x Earle's溶液またはジカウイルス溶液のいずれかを50マイクロリットルを各ウェルにすばやく追加します。各オルガノイドが完全に水没していることを確認します。終了したら、プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻して2時間放置します。
ウイルス曝露が完了した後。オルガノイドの各ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄します。オルガノイドを15秒間沈降させてから、シングルチャンネルP200ピペットを使用してPBSを除去します。最後に、200マイクロリットルの新鮮な神経誘導培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。