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野生型および変異型ショウジョウバエの脳を、固定剤と界面活性剤を含む溶液に入れます。穏やかに揺らしながらインキュベートします。
固定剤は組織の形態を維持し、界面活性剤は細胞膜を透過します。
脳を落ち着かせてから、溶液を取り除きます。
バッファーで組織を洗浄します。
非特異的抗体結合を防ぐためにブロッキング溶液を追加します。
溶液を取り出し、脳のキノコ体(MB)ニューロンの軸索発達を調節する特定のタンパク質を標的とする一次抗体を追加します。
抗体結合を促進するためにインキュベートします。
バッファーで洗浄して、結合していない抗体を除去します。
一次抗体を標的とする蛍光色素結合二次抗体とインキュベートします。
再度洗浄して結合していない抗体を除去し、脳を封入培地に再懸濁します。
脳をブリッジスライドに取り付け、蛍光顕微鏡で視覚化します。
野生型と比較して、変異型脳は、軸索の誤った投影とMB葉の欠損を伴う欠陥のある表現型を示します。
顕微鏡下で、P200ピペットを使用して、同じ遺伝子型で10〜15個の解剖された脳を、PTNで希釈した4%パラホルムアルデヒドで満たされた0.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。次に、室温でゆっくりと揺らしながら脳を20分間インキュベートします。固定後、脳をチューブの底に落ち着かせてから、固定剤を取り除きます。
次に、洗浄ごとに500マイクロリットルのPTNを使用して2回のクイック洗浄を行います。脳がチューブに落ち着いたらすぐにPTNを交換します。次に、室温で穏やかに撹拌し、PTNで3回長時間洗浄します。
これらの洗浄の後、脳は摂氏4度でPTNで一晩保存される場合があります。最後のPTN洗浄液を除去した後、脳を0.5ミリリットルのブロッキング溶液中で室温で少なくとも30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。ブロッキング溶液を除去した後、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加え、穏やかに撹拌しながら脳を摂氏4度で2日間インキュベートします。
5洗浄PTN洗浄レジメンを使用して一次抗体を除去し、二次抗体を適用します。これらの抗体を、光から遮断しながら室温で3時間組織とインキュベートさせます。
二次抗体溶液中で脳をインキュベートした後、PTN洗浄レジメンを適用し、各洗浄後にサンプルをホイルで覆い、できるだけ多くのバッファーを除去して終了します。次に、75マイクロリットルの蛍光色付き防止封入剤を加え、ブレインと培地をピペットチップに一度だけ出し入れします。その後、チューブをホイルで包み、摂氏4度で数日間保管できますが、理想的には直接取り付けを進めてください。
頭脳を取り付けるには、ブリッジスライドを構築します。2つのベースカバーガラスを約1センチメートル離して、正に帯電したスライドに配置します。正に帯電したスライドが表向きになっていることを確認してください。次に、カバーガラスを指のマニキュアでスライドに貼り付け、ポリッシュを完全に乾かしてから続行します。
次に、スライドを実体顕微鏡下に置き、ブレインと培地をカバーガラスの間のスペースにピペットで入れます。脳の視覚化を改善するために、必ず照明を調整してください。
次に、脳を避けるように注意しながら、スライドから余分な取り付け媒体を吸引します。次に、残っている余分な取り付け媒体を吸い取ります。これにより、脳をより正確に配置できるようになります。
次に鉗子を使用して、触角葉を上に向けて脳を格子状に向けます。次に、頭脳の上にカバーガラスを置き、指のマニキュアを使用して、ベースのカバーガラスに取り付けられている上部のカバーガラスの端をシールします。次に、中央のキャビティに新しい取り付けメディアをドロップしてロードし、キャピラリーの作用によってメディアをカバーガラスの下に引き込むことができます。空洞が満たされたら、透明な指のマニキュアを使用して完全に密閉します。