大規模走査型透過電子顕微鏡によるゼブラフィッシュ幼生脳損傷の検討

1 穴のグリッドに取り付けられた、健康で脳損傷したゼブラフィッシュの幼虫から、樹脂が埋め込まれ、化学的に固定された極薄の脳切片を取ります。

切片は重金属で染色され、顕微鏡イメージング中の画像のコントラストが向上します。

グリッドをサンプルホルダーに入れ、ホルダーを顕微鏡チャンバーに移します。

電子ビームを生成する電子銃の下にグリッドを合わせます。

電磁レンズとコイルの配列が電子ビームをセクションに集束させます。

サンプルホルダーを動かして、ラスターパターンでセクションをスキャンします。

電子ビームが組織切片を通過すると、染色された電子密度の高い領域はより多くの電子を散乱させ、染色されていない領域は電子を透過します。

検出器はこれらの電子信号を収集し、高解像度の脳画像を作成します。

対照と比較して、損傷した脳は、損傷誘発性神経変性の特徴である多数の細胞内封入体を含む食作用性ミクログリアを示します。

走査型電子顕微鏡またはSEMにサンプルを取り付けるには、トランスファーボックスからグリッドをマルチグリッドサンプルホルダーにセクションを置き、SEMのチャンバーに移します。テキストプロトコルに従って検出器を位置合わせした後、スキャンする領域全体が画像ウィンドウに収まるようにズームアウトしてサンプルを事前に照射します。絞りを 120 マイクロメートルに変更し、画像の焦点をぼかしたら、縮小領域スキャン オプションを使用して、スキャン領域をできるだけ狭くします。

次に、フレームレートを約1〜2秒でスキャンするように設定します。次に、少なくとも 100 倍にズームインし、小さな領域を 10 秒間スキャンします。それでもその領域の明るさが変化する場合は、照射前を続けてください。この領域が周囲と比較して明るさが変化しない場合は、事前照射で十分です。

ピントを合わせた状態で、最も明るい領域または特徴を選択し、細部が見えるようにスキャン速度を設定します。顕微鏡ソフトウェアで、ヒストグラムを注意深く観察して明るさとコントラストを調整し、すべてのピクセルをダイナミックレンジに保ちます。最も暗い領域と特徴についても同じことを行います。明るい領域に戻り、ヒストグラムの両側にスペースがあることをもう一度確認します。

ステップ4〜6〜4〜8では、領域全体がダイナミックレンジ内になるように、明るさとコントラストの調整を非常に慎重に行う必要があります。

スキャンする領域全体がイメージングウィンドウに収まるようにズームアウトし、大面積取得プログラムを開始します。次に、ウィザード オプションを使用して、画面から領域を選択してモザイクを設定します。

必要な詳細に応じて2〜5ナノメートルのピクセルサイズを使用し、走査型透過型電子顕微鏡またはSTEMの滞留時間を3マイクロ秒に設定します。最適化を押して顕微鏡の設定を確認すると、必要な時間が表示されます。次に、外部スキャンジェネレータの電源を再度オンにして、[続行]を押します。