ヒト胚性幹細胞の神経オルガノイドへの分化と成熟

培地中のヒト胚性幹細胞から始めます。

細胞増殖と球体形成のためにインキュベートします。

これらの球体を、分化因子を含む培地を含む新しいウェルに移します。

穏やかに振ってインキュベートします。分化因子は幹細胞を神経系統に向かって駆り立てます。

媒体の半分を定期的に交換してください。

培地を神経誘導培地に置き換え、インキュベートして神経前駆細胞を取得します。

成長因子が豊富な培地に切り替えてインキュベートし、細胞増殖と神経ロゼット形成を促進します。

次に、阻害剤を含む培地で培養して、望ましくない細胞分化をブロックします。

この培地を成長因子と阻害剤を含む培地に置き換えてください。インキュベートしてグリア細胞と初代ニューロンへの分化を誘導します。

その後、ニューラルロゼットを、阻害剤が豊富な成熟培地を含むインサート運搬ウェル内の疎水性膜上に置きます。

振とうせずにインキュベートして、神経細胞とグリア細胞が気液界面で成熟し、神経オルガノイドを形成します。

マイクロウェルあたり1,000千個の細胞を分注します。細胞を300倍gで5分間遠心分離し、マイクロウェルプレート内の細胞の均一な再分割を顕微鏡下で確認します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。

翌日、マイクロウェルプレートを調べて、各マイクロウェルに形成された球のサイズを確認します。培地を使用して球体を6ウェルプレートに移し、デュアルSMAD阻害カクテルを添加して迅速な神経誘導を促進します。このステップから、球体は60 RPMで回転して培養され、球体が互いにくっついたり、プレートにくっついたりするのを防ぎます。1〜4日目に、神経誘導を行う前に2〜3日ごとに培地を交換します。

4日目から11日目まで、デュアルSMADカクテルを添加して、1ミリリットルあたり10ナノグラムのEGFとbFGFをB27培地に添加することにより、hESC由来の神経ロゼットの増殖を促進します。11日目から13日目まで、0.5マイクロモルのBMP阻害剤を添加したB27培地で球体を培養します。13日目から21日目まで、GDNFとBDNFを10ナノグラム/ミリリットルで添加したB27培地と1マイクロモルのガンマセクレターゼ阻害剤で球体を培養します。

21日目に、新しい6ウェルプレートの1つのウェルに1つの培養プレートインサートを配置します。その後、成長因子と阻害剤を添加した1ミリリットルのB27培地を、メンブレンインサートの下の各ウェルに加えます。続いて、培養プレートインサートに堆積した親水性PTFE膜に球体をプレーティングし、次の3週間の分化の間、2〜3日ごとに培地を交換します。このステップから回転を停止します。

ロゼットの存在は、神経分化の開始を示しています。21日目から25日目まで、同じ神経成熟培地でヒト神経オルガノイドを培養します。次に、25日目から28日目まで、B27培地を1つのマイクロモルガンマセクレターゼ阻害剤で補完するだけです。28日目から39日目まで、ガンマセクレターゼ阻害剤の添加を中止し、B27培地のみでヒト神経オルガノイド培養を継続します。3週間後、神経オルガノイドはGIC移植に使用する準備が整います。