ヒト胚性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンオルガノイドの作製

ヒト胚性幹細胞(hESC)を細胞外マトリックスコーティングフラスコに入れます。

培地を神経誘導培地に交換し、インキュベートして、hESCを神経前駆細胞(NPC)コロニーに分化させます。

酵素溶液を加えてコロニーを解離させます。

遠心分離し、上清を除去し、NPCの分化をサポートするために成長因子を含む誘導培地に細胞を再懸濁します。

細胞懸濁液を逆ピラミッド型のマイクロウェルに添加して、3次元の神経球を形成します。

成長因子と小分子を含む分化培地を含む細胞外マトリックスコーティングプレートに神経球を移します。ドーパミン作動性前駆神経細胞への分化を促進するために攪拌下でインキュベートします。

培地を神経成熟培地に交換し、カルチャーウェルインサートのメンブレンディスクに神経球を配置して、空気と栄養素の拡散を可能にします。

静的条件下でインキュベートして、成熟したドーパミン作動性ニューロンからなる三次元オルガノイドを形成します。

これらのオルガノイドは、発達中の脳を模倣しており、パーキンソン病の特徴であるドーパミン作動性ニューロン変性症の研究に役立ちます。

hESCの多能性機能を維持するために使用される幹細胞培地を、神経誘導を開始するためのデュアルSMAD阻害カクテルを含む無血清培地と、翌日の継代中の細胞の生存率を高めるために10マイクロモルのROCK阻害剤に置き換えます。1日目に、同じ濃度のROCK阻害剤とデュアルSMAD阻害分子を含む無血清培地のウェルあたり2.5ミリリットルでマイクロウェルプレートを調製します。

神経管腹側パターンに向かって細胞を分化させるには、100ナノグラム/ミリリットルのSHHとFGF8、および2マイクロモルの平滑化アゴニストを追加します。培地を加えた後、プレートを1,200倍gで5分間遠心分離して、マイクロウェルから気泡を除去します。マイクロウェルプレートを半分化培地で使用する準備ができたら、hESCの培地を取り除き、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないPBSですばやく洗浄します。

7.5 mLの組換え酵素溶液をT75フラスコに加えることにより、コロニーを単一細胞懸濁液に解離させます。細胞を摂氏37度で2分間インキュベートし、DMEM F-12 7.5個を加えます。続いて、細胞懸濁液を回収し、300回gで5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、マイクロウェルプレートの調製に使用したのと同じ培地で細胞をカウントします。

培地の容量を調整して細胞懸濁液を取得し、2.5ミリリットルの培地に470万個の細胞を調製し、プレートにすでに配置された以前の2.5ミリリットルの培地に添加することにより、マイクロウェルあたり1,000個の細胞を含むニューロスフィアを形成できるようにします。各マイクロウェルに細胞を正しく分布させるために、プレートを軽く振って、300 g で 5 分間遠心分離します。次に、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートして球体を作ります。

2日目に、マイクロウェルを培地で穏やかに洗い流し、組織処理された6ウェルプレートに球体を移します。球体を摂氏37度で回転させ、培地の半分を2〜3日ごとに新鮮な培地に交換します。3〜13日目に、神経誘導を強化し、中脳同一性を持つ神経前駆細胞に変換するために、培地に3マイクロモルのGSK-3-ベータ阻害剤を補充します。サンプルを2つの新しい組織処理された6ウェルプレートに分割して、球の密度を下げ、球の凝集を回避します。

8日目に、成長因子を含む新しい培地に切り替えて神経成熟を開始し、2〜3日ごとに培地を交換します。21日目に、新しい6ウェルプレートの1つのウェルに1つの培養プレートインサートを置き、メンブレンインサートの下に神経球の分化に使用される1.2ミリリットルの神経成熟培地を加えます。次に、PTFEメンブレンを培養プレートインサートに配置します。

最後に、神経オルガノイドを生成するには、PTFE膜上の気液界面条件下で約100個の神経球を播種します。このステップからローテーションを停止し、必要な分化時点に達するまで2〜3日ごとに培地を交換します。