ゼブラフィッシュ幼生における薬物誘発性出血のモデリング

胚培地に受精ゼブラフィッシュ胚を含む培養皿から始めます。

皿を実体顕微鏡下に置き、解剖鉗子を使用して、胚を取り囲む外膜である絨毛膜を除去します。

これにより、胚を周囲の培地にさらすことができます。

これらの絨毛膜除去胚を、脳の血管の完全性を維持するために重要なコレステロールの合成を阻害する薬剤を含む胚培地を含む皿に移します。

胚が幼虫に成長するまで、制御された温度でインキュベートします。

時間が経つにつれて、薬は発育中の幼虫に浸透し、コレステロール合成を阻害します。

コレステロール欠乏症は脳の血管を弱め、血管が破裂して脳に血液が漏れ、出血性スポットが発生します。

実体顕微鏡で幼虫を観察します。

はっきりとした赤い斑点のある出血性幼虫を非出血性集団から分離します。

これらの出血性幼虫を新しい皿に移して、さらなる研究を行います。

受精後 24 時間で、明視野実体顕微鏡下で、鋭利な極薄解剖鉗子を使用して、アトルバスタチン治療のために胚を脱絨毛膜化します。次に、30ミリリットルのE3胚培地を2つのきれいなペトリ皿に加え、1つは治療用、もう1つは対照用です。処理皿から60マイクロリットルの胚水を取り出し、60マイクロリットルの0.5ミリモルアトルバスタチンを加えて、出血した幼虫の80%を達成します。

パスツールピペットを使用して、100個の胚をできるだけ少ない水で各皿に移します。2つの皿を摂氏28度でインキュベートします。受精後50時間後いつでも、顕微鏡下でパスツールピペットを使用して、出血していない個体群から出血した魚を注意深く分離し、幼虫を新鮮なE3培地を含む新しい皿に移します。

出血陽性の幼虫を分離しやすくするために、色素のない魚や赤血球で蛍光タンパク質を発現する魚を使用できます。