神経前駆細胞およびニューロンにおけるシアロ糖タンパク質の免疫蛍光染色

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アル酸レポーターによってタグ付けされたシアロリコタンパク質を持つ初代神経幹細胞と前駆細胞とニューロンを取り上げます。

パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定します。バッファーを使用して余分なパラホルムアルデヒドを除去します。

ビオチンベースの化学プローブ、還元剤、および金属ベースの触媒を含む反応混合物でインキュベートします。

還元剤は触媒を活性化し、シアロリコタンパク質のビオチン化を促進します。

反応混合物を取り出し、バッファーで洗浄します。蛍光色素結合ストレプトアビジンを添加して、ビオチン化シアログリコタンパク質に結合します。

結合していないストレプトアビジンを取り除き、バッファーで洗浄します。タンパク質と非イオン性界面活性剤を添加して、非特異的部位をブロックし、細胞を透過処理します。

この溶液を取り出し、特定の細胞タンパク質を標的とする一次抗体とインキュベートします。

結合していない抗体を除去します。

蛍光色素でタグ付けされた二次抗体および蛍光色素とインキュベートして、タンパク質結合一次抗体に結合し、核を標識します。

結合していない分子を除去します。バッファーで洗浄します。

蛍光顕微鏡を使用して、細胞を画像化して、蛍光シアロリコタンパク質と細胞タンパク質を視覚化します。

まず、共培養プレートからインサートを取り外し、ウェルの底から培地を吸引します。次に、予熱したPBSで神経細胞を一度洗浄します。ウェルからPBSを吸引し、PBS中の予冷4%パラホルムアルデヒド1ミリリットルを各ウェルに加えます。

細胞を室温で10分間固定します。次に、細胞を予冷PBSで3回洗浄します。PBSを吸引し、1ミリリットルの新たに調製したビオチン結合バッファーIを各ウェルに加えます。室温で10分間インキュベートします。この後、ウェルから反応バッファーを吸引し、細胞をPBSで3回洗浄します。細胞の各ウェルに1ミリリットルの染色バッファーを加え、室温で30分間インキュベートします。

次に、ウェルから染色バッファーを吸引し、事前に冷却したPBSで細胞を3回洗浄します。細胞の各ウェルに1ミリリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で10分間インキュベートします。ウェルからブロッキングバッファーを取り出し、各ウェルに1ミリリットルの一次抗体溶液を加えます。細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、一次抗体溶液をウェルから取り出します。細胞を予冷PBSで3回洗浄します。ウェルからPBSを吸引し、各ウェルに1ミリリットルの二次抗体を加えます。細胞を室温で2時間インキュベートします。この後、ウェルから溶液を吸引し、細胞を予冷PBSで3回洗浄します。