神経成長円錐崩壊に対する凝集アミロイドβのin vitro評価

マウス

胚由来のニューロンを含むマルチウェル培養スライドを培地中に入れることから始めます。

ニューロンは、成長する軸索の先端に成長円錐を示します。これらの構造には、糸状足と呼ばれる薄い突起と、細胞骨格の構成要素であるアクチンフィラメントと微小管で構成される層状の延長板状の延長が含まれます。

テストウェルを凝集したアミロイドβ(Aβ)タンパク質で処理し、コントロールウェルをビヒクル溶液で処理します。

テストウェルでは、凝集したAβが膜受容体に結合し、細胞骨格調節タンパク質をリン酸化する下流のシグナル伝達を開始します。

リン

酸化タンパク質はアクチンフィラメントと微小管を破壊し、成長円錐の構造的完全性を不安定

にし、崩壊を引き起こします。

細胞構造を保存するために固定剤と一緒にインキュベートし、細胞を洗浄してイメージング用にマウントします。

顕微鏡を使用して、テストウェルとコントロールウェルの細胞構造を比較します。

Aβ処理ニューロンにおける成長円錐崩壊の発生の増加は、Aβ凝集体の毒性作用を示しています。

この

アッセイは、市販の完全長A-ベータ-42の新鮮なバイアルを開き、内容物を滅菌蒸留水に0.5ミリモルの濃度に溶解することにより、少なくとも1週間前に開始します。摂氏37度で7日間インキュベートして、凝集と毒性を誘発します。凝集したA-β-42のアリコートを調製し、使用するまでマイナス80°Cで保存してください。

ニューロン培養の4日目に、前述のように、100マイクロリットルの0.5マイクロモル凝集A-ベータ-42または培地B中のビヒクル溶液でウェルを1時間処理します。1時間が経過したら、培地を取り出し、すぐにPBS中の4%パラホルムアルデヒドを含む4%パラホルムアルデヒドでニューロンを37°Cでホットプレート上で1時間固定します。

このプロトコルでは成長円錐の形状を維持することが重要であるため、固定が最も重要です。

固定後、ニューロンをPBSで3回洗浄します。次に、チャンバーを取り外した後、ニューロンを水性封入媒体でマウントします。封入剤を摂氏4度で2〜4日間乾燥させます。倒立顕微鏡で20倍のドライ対物レンズで各ウェルの全領域をキャプチャします。

各井戸の領域全体をキャプチャして分析することは、主観性を避けるために重要です。

ステージ3または4の各ニューロンの最も長い神経突起を軸索として分類します。ラメリポディアを欠いている、または糸状足が3つ未満の軸索成長円錐は、崩壊した成長円錐と見なされます。