ラットモデルにおける脳微小出血の検出

脳微小出血 (CMH) は、血液脳関門の破壊によって引き起こされる神経炎症性脳出血であり、その結果、赤血球 (RBC) が脳組織に漏出します。

CMHを検出するには、CMHを持つラットの固定脳組織から始めます。

凍結保護のために組織をスクロースに浸します。

クライオミクロトームを使用して、組織を切片化し、スライドガラス上に切片を収集します。

洗浄

して残留固定液を取り除きます。

負に帯電したDNAと相互作用する金属カチオンに結合したヘマトキシリン色素を塗布し、核を赤紫色に染色します。

続いて酸性アルコールで余分な染料を除去し、アルカリ性ブルーイング剤を塗布して酸性環境を中和し、染料を青色に変換してコントラストを高めます。

組織をアルコールで洗浄して染色の浸透を改善し、次にエオシンを塗布して赤血球を赤オレンジ色に染色し、組織成分をピンク色に染色します。

アルコール濃度を上げて組織を脱水し、キシレンで透明化して顕微鏡で視覚化します。

画像をキャプチャして赤オレンジ色の漏出赤血球を検出し、CMHを確認します。

脳を単離した後、PBSの20%スクロースに少なくとも6時間、または脳がチューブの底に沈むまで浸漬します。溶液を30%ショ糖に変更し、さらに6時間固定します。

最後に、クライオスタットを使用して厚さ10mmの脳組織切片を準備します。スライドを蒸留水で洗浄して、H&E染色を開始します。次に、ヘマトキシリン溶液に8分間浸します。染色後、流水道水で5分間洗います。1%酸アルコールで30秒間分化します。

流水道水で1分間洗浄した後、0.2%アンモニア水または飽和炭酸リチウム溶液で30秒から1分間染色します。次に、流水道水で5分間洗います。エオシン溶液で30秒から1分間対比染色します。90%アルコール、次に95%アルコール、無水アルコールでそれぞれ0.5〜2分間脱水します。

脱水後、キシレンで30秒間クリアします。実装後、明視野蛍光顕微鏡を使用してH&E染色を分析します。CMHの構成要素である血管から放出された赤血球は、H&E染色下で赤オレンジ色に現れます。