リサイクルシナプス小胞の光学解析のための培養ニューロンの準備

蛍光タグ付きシナプトフィシンやシナプトタグミン-1を含むシナプス小胞膜タンパク質を発現する培養ニューロンを含むカバーガラスから始めます。

培地を取り出し、脱分極バッファーと一次抗体の混合物を加えてからインキュベートします。

緩衝イオンが細胞に入り、シナプス小胞と膜の融合を刺激し、シナプトタグミン-1を露出させます。

一次抗体は、露出したシナプトタグミン-1に選択的に結合します。

バッファーを廃棄し、培地で洗浄して、結合していない抗体を除去します。

新鮮な培地を導入してインキュベートして膜の内在化を促進し、標識シナプトフィシンと抗体結合シナプトタグミン-1でリサイクル小胞を形成します。

培地を取り出し、細胞を固定し、洗浄します。

蛍光色素共役二次抗体を含む界面活性剤ベースのブロッキングバッファーを導入します。

界面活性剤は細胞を透過性化し、二次抗体が抗体結合シナプトタグミン-1と相互作用できるようにします。

カバーガラスを持ち上げて水洗いし、乾かします。

カバーガラスを裏向きにして、二重標識リサイクル小胞の光学分析のために包埋培地を含むスライドの上に置きます。

600マイクロリットルの1x脱分極バッファーと10ミリリットルの細胞培養培地をウォーターバスで摂氏37度に予熱します。1マイクロリットルのマウス抗SYT1抗体を1x脱分極バッファーに加え、10秒間ボルテックスします。細胞から細胞培養培地を除去して廃棄した後、200マイクロリットルの脱分極抗体混合物を各ウェルに加えます。

プレート

をインキュベーター内で摂氏37度、5%CO₂で5分間インキュベートします。脱分極抗体混合物を取り出して廃棄し、細胞培養培地で細胞を3回洗浄します。各ウェルに1ミリリットルの細胞培養培地を加え、室温で30秒間インキュベートします。

次に、750マイクロリットルの培地を取り出し、同量の新鮮な培地を加えます。このプロセスを3回繰り返します。次に、細胞培養培地を取り出して廃棄し、300マイクロリットルの4%PFAを1x PBSに加えます。

最後に、摂氏4度で20分間インキュベートしてから、1x PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。二次蛍光色素共役抗体を、各ウェルのブロッキングバッファーで1〜1,000の希釈で200マイクロリットルで希釈します。培養ニューロンを含むカバーガラスを含む各ウェルから1x PBSを取り出し、廃棄します。

200マイクロリットルのブロッキングバッファー抗体混合物を各ウェルに加え、室温で60分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を1ミリリットルの1x PBSで5分間3回洗浄します。

次に、7マイクロリットルの包埋培地を顕微鏡スライドに滴下します。カバーガラスをカニューレで持ち上げ、鉗子でつかんで、24ウェルプレートからカバーガラスを取り外します。カバ